miR-204对癫神经元中BDNF/TrkB信号通路的影响*

常 伟 潘立平 吴秋静 宋毅军△

实验研究

常 伟1潘立平2吴秋静1宋毅军2△

目的研究海马神经元癫模型中转染miR-204后对脑源性神经营养因子（BDNF）与TrkB通路调控作用的影响。方法取原代培养7 d后的细胞，分为正常组、正常+BDNF组、癫组、癫+BDNF组、正常转染miR-204组、癫转染miR-204组、癫转染miR-204+BDNF组。癫组用无镁液处理3 h制作癫模型。制备成功miR-204慢病毒表达载体。采用免疫荧光、膜片钳及免疫印迹技术鉴定及观察miR-204对BDNF/TrkB通路表达的影响。结果TrkB蛋白的磷酸化水平：正常+BDNF组高于正常组；癫+BDNF组低于正常+BDNF组，高于癫组；癫+miR-204+BDNF组高于癫+BDNF组和癫+miR-204组。结论BDNF及miR-204可以改善BDNF/TrkB受抑制的状态，从而在癫疾病的缓解中可能发挥重要作用。

癫；海马；神经元；受体,trkB；微RNAs；脑源性神经营养因子；miR-204

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级健康SD大鼠雌性10只，雄性2只，先取雌性6只，按比例（雌∶雄为3∶1）与雄性2只合笼饲养，雌性怀孕后取出，将余下4只陆续放入与雄性合笼。取24 h新生大鼠用于实验。分离大鼠的海马组织，胰蛋白酶消化完全后置于DMEM/F12培养基终止消化，经过吹打计数接种于培养皿里，孵育箱培养7 d。将原代培养7 d的神经元细胞随机分为7组：正常组、正常+BDNF组、癫组、癫+BDNF组、正常转染miR-204组、癫转染miR-204组、癫转染miR-204+BDNF组。转染miR-204组细胞加入慢病毒稀释液20 μL，加BDNF组均在细胞收集前10 min加入BDNF 2 μL。

1.2 方法

1.2.1 miR-204表达载体构建 用Trizol法及琼脂糖凝胶电泳提取并鉴定RNA纯度和完整性。将其逆转录合成cDNA，经PCR扩增并与Lentivector质粒载体双酶切后水浴连接，用其转化宿主菌。将包装质粒导入293T细胞，收集上清液。

1.2.2 MAP2和DAPI双染免疫荧光鉴定海马神经元 于6孔板中接种海马神经元细胞，经多聚甲醛固定、Triton X-100通透后，加入山羊血清封闭液封闭（北京中杉金桥生物技术有限公司），滴加一抗MAP-2单克隆抗体（美国CST公司）及二抗FITC-山羊抗小鼠IgG（美国santacruz公司），DAPI染核，甘油封片，于倒置相差荧光显微镜下釆集图像。

1.2.4 免疫印迹（Western blot）法检测蛋白表达水平 将7组细胞经细胞裂解液裂解，收集细胞后经超声离心及与蛋白上样缓冲液煮沸制备蛋白质样品。取等量样品经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，偏二氟乙烯（PVDF）膜转膜，Western blot封膜液及脱脂奶粉封闭，分别加入TrkB及磷酸化TrkB（p-TrkB）兔抗大鼠多克隆抗体及大鼠抗β-actin单克隆抗体，加入山羊抗兔及山羊抗鼠二抗，采用化学发光检测系统（Pierce，USA）及SYNGENE ChemGenius系统成像收集数据。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件包对数据进行分析。计量资料采用±s表示，Levene方法进行方差齐性检验，成组设计2组样本均数比较用t检验，多样本均数的比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 免疫荧光法鉴定海马神经元结果 镜下观察其神经元纯度约60%～70%。且癫状态的神经元细胞形态与正常组的细胞相比并无明显改变，见图1。

Table 1 The frequency and amplitude of cell discharge in control group and epilepsy group表1 正常组和癫组细胞放电的频率和幅度（±s）

Table 1 The frequency and amplitude of cell discharge in control group and epilepsy group表1 正常组和癫组细胞放电的频率和幅度（±s）

＊P＜0.05

组别正常组癫幅度（mV）67.18±1.51 75.76±1.73 10.715＊组n66 t频率（Hz）0.28±0.11 4.41±0.37 20.422＊

Figure 2 The cell discharge in control group and epilepsy group图2 正常组和癫组细胞放电

2.3 Western blot检测TrkB蛋白的磷酸化水平实验结果 正常+BDNF组高于正常组；癫+BDNF组低于正常+BDNF组、高于癫组；癫+miR-204+BDNF组高于癫+BDNF组和癫+miR-204组，见表2、图3。

3 讨论

BDNF和TrkB是所有神经营养因子中唯一一对在时间和空间上协同表达的受体配体复合物。当BDNF与TrkB结合时，受体分子二聚化，其多个氨基酸残基快速自动磷酸化，磷酸化的转录因子移入细胞核并与特定基因的启动子区结合,启动转录过程[7]。酪氨酸磷酸化的TrkB作为BDNF信号转导途径的中介将信号进一步传递给下游的衔接蛋白及其相关活性酶，通过水解磷脂酶C（PLCγ）、磷脂酰环己六醇激酶-3（PI3K）、细胞外信号调节激酶（ERK）、促细胞分裂活性蛋白激酶（MAPK）等信号通路激活，通过细胞内Ca2+发挥作用，且调节BDNF、TrkB mRNA的转化和蛋白向树突的运输，从而发挥作用[8-9]。海马神经元在兴奋性毒性损伤前与神经营养蛋白共培养，能够通过BDNF激活Ras/ERK和PI3-K/Akt通路的神经保护作用[10]。miR-204位于人类9号染色体上，其可以直接与TrkB的3＇-UTR结合，通过对TrkB表达的调节，增加神经母细胞瘤的化疗药物耐受[6]。

Table 2 Comparison of the phosphorylation levels of TrkB between seven groups表2 各组海马神经元TrkB蛋白的磷酸化水平比较（n=6±s）

Table 2 Comparison of the phosphorylation levels of TrkB between seven groups表2 各组海马神经元TrkB蛋白的磷酸化水平比较（n=6±s）

TrkB蛋白的磷酸化水平以各组p-TrkB/TrkB灰度值与正常组的比值表示

P组别正常组（1）正常+BDNF组（2）癫 组（3）癫+BDNF组（4）正常+miR-204组（5）癫统计学处理组比（1）∶（2）（2）∶（4）（3）∶（4）（4）∶（7）（6）∶（7）＜0.001＜0.001 0.034＜0.001＜0.001+miR-204组（6）癫+miR-204+BDNF组（7）F TrkB蛋白的磷酸化水平1 3.09±0.05 0.75±0.11 1.52±0.08 1.34±0.21 1.13±0.13 3.49±0.59 19.123＊＊

Figure 3 Results of Western blot for p-TrkB,TrkB and β-actin in seven groups图3 各组海马神经元p-TrkB、TrkB及内参β-actin蛋白Western blot图

本实验中，TrkB蛋白的磷酸化水平在正常+BDNF组明显高于正常组，说明正常状态下BDNF/TrkB信号通路可以由BDNF的加入而激活。癫+BDNF组高于癫组，说明癫状态下此信号通路也可由BDNF的加入而激活。癫+BDNF组较正常+BDNF组降低，可能是由于癫状态下完整型的TrkB表达下降，而缩短型的升高，缩短型的TrkB对完整型的TrkB磷酸化起抑制作用，因此会出现BDNF/TrkB通路受到抑制。癫+miR-204+BDNF组较癫+BDNF组和癫+miR-204组升高，可见在癫状态下高表达的缩短型TrkB表达下降，进而解除癫中BDNF/TrkB通路的抑制状态。以上提示癫状态下缩短型TrkB的显性抑制效应可以抑制BDNF/TrkB通路活化，而miR-204可以下调缩短型TrkB表达而再次激活BDNF/TrkB通路。

Figure 1 The MAP-2 and DAPI fluorescence staining of control group and epilepsy hippocampal neuron group(×400)图1 正常组和癫组海马神经元MAP-2和DAPI荧光染色（×400）

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（2013-10-10收稿 2013-11-18修回）

（本文编辑 闫娟）

The Study of miR-204 Regulates BDNF/TrkB Expression in Epileptic Neurons

CHANG Wei1,PAN Liping2,WU Qiujing1,SONG Yijun2
1 Grade 2007,7-Year Educational System,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Department of Neurology,General Hospital of Tianjin Medical University

ObjectiveTo study the effect of miR-204 on BDNF/TrkB signaling and pathogenesis on the neuron model of epilepsy.MethodsPrimary hippocampal neurons were cultured in vitro for 7 days,and were divided into control group,control+BDNF group,epilepsy group,epilepsy+BDNF group,control+miR204 group,epilepsy+miR204 group and epilepsy+miR204+BDNF group.The epilepsy model of hippocampal neurons was established by being exposed to Mg2+free media for 3 hours.The miR-204 lentivirus vector was constructed.The effect of miR-204 on BDNF/TrkB expression was detected by immunohistochemistry,patch clamp and Western blot technique.ResultsCompared with the control group,the TrkB phosphorylation level was higher in control+BDNF group.The TrkB phosphorylation level was lower in epilepsy+BDNF group than that of control+BDNF group,but it was higher than that of epilepsy group.The TrkB phosphorylation level was higher in epilepsy+miR204+BDNF group than that of epilepsy+BDNF group and epilepsy+miR204 group.ConclusionBDNF and miR-204 can improve the inhibitory condition of BDNF/TrkB signaling and may play an important role in alleviating epilepsy disease.

epilepsy；hippocampus；neurons；receptor,trkB；microRNAs；brain-derived neurotrophic factor；miR-204

R749.1 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.007

*国家自然科学基金资助项目（项目编号：91132722、81071044）

1天津医科大学七年制2007级（邮编300070）；2天津医科大学总医院神经内科

△通讯作者 E-mail:songyijun2000@gmail.com