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广西2月龄内犊奶牛隐孢子虫感染情况调查

2014-08-08魏晓瑞谢永平闭炳芬陈泽祥韦志锋秦若甫兰美益王晓丽

中国兽医杂志 2014年3期
关键词:卵囊孢子犊牛

魏晓瑞,陶 立,李 军,谢永平,闭炳芬,陈泽祥,韦志锋,秦若甫,兰美益,彭 昊,杨 威,王晓丽

(1.广西大学动物科学技术学院,广西 南宁 530005;2.广西兽医研究所,广西 南宁 530001;3.广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西 南宁 530001)

自Tyzzer(1907)首次发现小鼠隐孢子虫(C.muris)以来,国内外学者对隐孢子虫病进行了大量研究,已在人、哺乳动物、禽类、爬行动物和鱼类等多种动物中发现15个种类的隐孢子虫感染[1-3],其中可感染牛的隐孢子虫种为安氏隐孢子虫(C.an⁃dersoni)、小球隐孢子虫(C.parvum)、牛隐孢子虫(C.bovis)、小鼠隐孢子虫(C.muris)、犬隐孢子虫(C.ca⁃nis)、猫隐孢子虫(C.fells)、猪隐孢子虫(C.suis)、鹿样基因型(C.deer-like genotype)和赖氏隐孢子虫(C.ryanae)[4-5]。隐孢子虫对牛的感染与牛的年龄呈正相关性[6]。本实验室对广西奶牛隐孢子虫病流行病学的调查结果显示,广西奶牛感染的隐孢子虫种类为安氏隐孢子虫,由于调查的时间错过了产犊高峰期,对2月龄内犊牛的调查样本数相对偏少,有可能造成漏检[7]。为了更能全面准确地反映广西奶牛隐孢子虫感染的种类和流行情况,本实验室在2011年9月至2012年1月采用醛-酯法预处理粪样,再经饱和糖溶液漂浮、抗酸染色法和PCR鉴定检测了广西7个黑白花奶牛场2月龄内犊牛隐孢子虫感染状况。

1 材料与方法

1.1 材料 待检粪样: 采集7个广西黑白花奶牛场617头2月龄以内犊牛的新鲜粪便,每头粪样10~30 g左右,分装于洁净的塑料袋内,编号和标记牛的日龄及自然状况,置4℃冰箱待检。

主要试剂及配制:乙酸乙酯溶液、10%福尔马林溶液、饱和蔗糖溶液(食用白糖500 g,蒸馏水350 mL,石炭酸7.0 mL,比重为1.28)。改良抗酸染色液分别是甲液(碱性复红4 g,95%酒精20 mL,石碳酸8 mL,蒸馏水100 mL)、乙液(硫酸10 mL,蒸馏水90 mL)、丙液(0.2 g孔雀绿溶于蒸馏水100 mL)。甲醇,2.5%重铬酸钾溶液。PCR Taq Mix、DNA Marker1,购自广州东盛生物科技有限公司;粪便基因组DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司。

主要仪器:PCR仪,购自TaKaRa公司;凝胶成像系统,购自Alpha Inotech公司。

1.2 方法

1.2.1 犊牛粪样处理和饱和蔗糖液漂浮 取每份粪样5~10 g,加适量10%福尔马林溶液,充分捣碎、搅匀,60目铜筛过滤,滤液再经260目尼龙筛过滤,将滤液置离心管中,3000 r/min离心10 min,弃上清液后,在沉淀中加入5倍体积以上的10%福尔马林溶液充分混匀,再加入福尔马林溶液2/5体积的乙酸乙酯溶液充分混匀,3000 r/min离心10 min,弃上清。沉淀中加入约3/4试管体积的蒸馏水充分混匀,3000 r/min离心10 min,弃上清。最后在沉淀中加适量的饱和蔗糖溶液,搅匀后3000 r/min离心10 min。用铁丝环蘸取表层液膜制片,于400×镜下观察。

1.2.2 改良抗酸染色法 取1.2.1的沉淀物涂片,自然干燥,甲醇固定5 min,滴加甲液于粪膜上,5~10 min后水洗;滴加乙液,1~5 min后水洗;滴加丙液,1 min后水洗,晾干后1000×油镜下观察。

1.2.3 卵囊形态学鉴定 每张玻片观察100个视野,在400×镜下测量卵囊的大小,根据卵囊的长短径计算卵囊指数,观察卵囊的形态结构。

1.2.4 PCR鉴定 取阳性粪样200 mg,应用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便DNA进行隐孢子虫的种类鉴定[8]。

2 结果

2.1 广西2月龄内犊奶牛隐孢子虫感染情况 共调查7个黑白花奶牛场,检测粪样617头份,其中6个场为隐孢子虫感染阳性场,共检出阳性粪样57头份,场均感染阳性率为9.24%(表1),隐孢子虫卵囊的检出与犊奶牛的年龄呈一定的相关性(图1)。

2.2 虫种鉴定

图1 隐孢子虫感染与犊牛日龄的关系

2.2.1 卵囊形态和大小 粪样经醛—酯法和饱和蔗糖溶液漂浮法处理后,用铁丝环蘸取粪样的表层液膜制片,于400×镜下观察发现隐孢子虫卵囊呈粉红色,椭圆形或圆形,囊壁薄而光滑,周围有淡绿色光圈,无微孔和极粒,内有月牙形的子孢子。经改良抗酸染色法处理的样品,在1000×油镜下观察,蓝绿色的背景上卵囊呈鲜艳的玫瑰红色,卵囊为椭圆形或圆形,囊内有月牙形的空泡,但多数卵囊内部结构不清楚(图2)。卵囊大小为6.26μm~8.38μm×4.20 μm~5.35μm,平均7.48μm×5.23μm,卵囊形状指数(长/宽)1.07~1.60,平均为 1.36(n=100)。

图2 隐孢子虫卵囊(改良抗酸染色法) (1000×)

2.2.2 PCR鉴定 应用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便DNA进行隐孢子虫的种类鉴定,结果表明检测到的隐孢子虫均为安氏隐孢子虫(图3)。

图3 PCR基因分型

3 讨论

对广西7个黑白花奶牛场的617头份2月龄内犊牛粪样检测发现,广西2月龄内犊奶牛隐孢子虫感染率为9.24%,57份阳性粪样检测到的卵囊形态学相近或一致,经PCR鉴定证实为安氏隐孢子虫,这和我们之前调查相一致[7],说明安氏隐孢子虫是感染广西黑白花奶牛隐孢子虫的主要种类。

研究表明,小球隐孢子虫是感染犊牛的主要隐孢子虫虫种,其感染高峰期为1-15日龄,21-60日龄奶牛感染的虫种60%~90%为小球隐孢子虫,其余为牛隐孢子虫、安氏隐孢子虫和鹿样基因型,3-11月龄仅见牛隐孢子虫、安氏隐孢子虫和鹿样基因型的感染,而无小球隐孢子虫感染[6-9];Wang等(2000)也认为小球隐孢子虫主要寄生于断奶前犊牛,牛隐孢子虫和赖氏隐孢子虫主要寄生于断奶后犊牛和青年牛,安氏隐孢子虫常见于成年牛[5]。我们的调查表明,目前广西2月龄犊牛感染的隐孢子虫种类为安氏隐孢子虫,是否还有小球隐孢子虫的感染还有待深入调查。

2月龄内犊牛由于还没有断奶,粪便中含脂质较多,黏稠不易被水洗开,即使用饱和蔗糖溶液漂浮也会因脂质颗粒无法观察到卵囊,用醛-酯法处理粪样可解决粪便中脂质的问题,大大地提高了检出率。

检测发现F场的阳性率特别高,达到34.0%。这与该场犊牛混群饲养、拥挤和环境卫生极差有关,粪尿横流极易污染饲料和水源,导致犊牛的重复感染。因此,一定要注意犊牛的饲养管理,按日龄大小分群,保持合理的饲养密度和空间,及时清除粪便、清扫场地,搞好环境卫生。

[1]Ryan U M,Monisp,Enemark H L,et al.Suis n sp(Apicomplexa:Cryptosporididae)in pigs(Susscrofa)[J].J Parasitol,2004,90(4):769-773.

[2]Fayer R,Santin M,Xiao L.Cryptosporidium bovis n sp(Apicom⁃plexa:Cryptosporididae)in cattle(Bos taurus)[J].J P arasitol,2005,91(3):624-629.

[3]Xiao L,Fayer R,Ryan U M,et al.Cryptosporidiumtaxonomy:re⁃centadvances and implications for public health[J].Clin Microbi⁃ol Rev,2004,17:72-97.

[4]梁楠,菅复春,宁长申,等.牛隐孢子虫和隐孢子虫病的研究进展[J].中国兽医科学,2006,36(12):1024-1030.

[5]Wang R,Ma G,Zhao J,et al.Cryptosporidium andersoni is the predominantspecies in pose-weaned and adult dairy cattle in Chi⁃na[J].Parasitol Int,2011,60(1):1-4.

[6]Wade S E,Mohammed H O,Schaaf S L.Prevalence of Giardia sp,Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium muris(C.andersoni)in 109 dairy herds in five counties of southeasten New York[J].Vet Parasitol,2000,93(1):1-11.

[7]陶立,陈泽祥,韦志锋,等.广西奶牛隐孢子虫病的流行病学调查[J].中国兽医科学,2012,42(7):742-746.

[8]彭昊,李军,陶立,等.牛隐孢子虫多重PCR方法的建立及应用[J].中国人兽共患病学报,2012,28(8):825-828.

[9]Santin M,Trout J M,Xiao Li,et al.Prevalence and age related variation of Cryptosporidium species and genotypes in dairy calves[J].Vet Parasitol,2004,122(2):103-117.

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