兴安杜鹃总黄酮抗氧化活性

2014-08-08王姝涵李玉桃孙墨珑

湖北农业科学 2014年8期

王姝涵+李玉桃+孙墨珑

摘要：为考察兴安杜鹃（Rhododendron dauricum L.）总黄酮对·OH、超氧阴离子自由基和亚硝酸盐的清除作用，以及对亚硝胺合成的阻断作用，采用超声波提取法，以95%（V/V）乙醇浸提兴安杜鹃叶和茎样品，紫外可见分光光度法测定兴安杜鹃提取物的总黄酮含量。结果表明，兴安杜鹃提取物对·OH、亚硝酸盐和超氧阴离子均有清除作用，对亚硝胺的合成具有阻断作用，且随着浓度的增大，清除或合成阻断作用增加。兴安杜鹃提取物对超氧阴离子的清除效果优于对·OH和亚硝酸盐的清除效果，叶提取物的清除作用强于茎提取物的清除作用。

关键词：兴安杜鹃（Rhododendron dauricum L.）；总黄酮；抗氧化活性；清除作用

中图分类号：R961．1文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）08－1895-03

Antioxidant Activities of Total Flavonoids from Rhododendron dauricum L.

ＷＡＮＧＳｈｕ－ｈａｎ，ＬＩＹｕ－ｔａｏ，ＳＵＮＭｏ－ｌｏｎｇ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００４０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｒａｔｅｓｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｌｅａｖｅｓａｎｄｓｔｅｍｓｏｆＲｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎｄａｕｒｉｃｕｍＬ．ｔｏｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ（·ＯＨ），ｏｘｙｇｅｎｒａｄｉｃａｌ（Ｏ２－），ｎｉｔｒｉｔｅ，ａｎｄｔｈｅｂｌｏｃｋｉｎｇｒａｔｅｏｆｓｙｎｔｈｅｓｉｓｔｏｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｂｙ９５％（V／V）ｅｔｈａｎｏｌｂｙｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｍｅｔｈｏｄ．ＵＶｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｌｅａｖｅｓａｎｄｓｔｅｍｓｏｆＲｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎｄａｕｒｉｃｕｍＬ．ｈａｄｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｎｄｂｌｏｃｋｉｎｇａｃｔｉｏｎ．Ａｌｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｏｎｔｏｒａｄｉｃａｌｓａｎｄｂｌｏｃｋｉｎｇａｃｔｉｏｎｏｆｓｙｎｔｈｅｓｉｓｗｅｒｅｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｏｎｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｏｏｘｙｇｅｎｒａｄｉｃａｌｗａｓｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｏｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌａｎｄｎｉｔｒｉｔｅ．Ｔｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｌｅａｖｅｓｗａｓａｌｉｔｔｌｅｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔｆｒｏｍｓｔｅｍｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎｄａｕｒｉｃｕｍＬ．；ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ；ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ

兴安杜鹃（Rhododendron dauricum L.）是杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron）的一种常绿灌木，又名映山红，达子香，主要分布于我国大小兴安岭、长白山和完达山区［1］。兴安杜鹃药用价值很高，具有止咳祛痰和抗菌作用，其主要成分为黄酮类化合物和挥发油成分［2］。叶子含杜鹃素、槲皮素、杜鹃醇、香草酸、丁香酸、原儿茶酸及多种萜类化合物；根中含强心甙、甾醇与三萜化合物、鞣质及酚类化合物［3-6］。植物中均含有抗氧化活性成分，抗氧化作用主要表现为清除自由基和螯合金属离子［7］。本研究考察兴安杜鹃总黄酮对羟自由基、亚硝酸盐和超氧阴离子的清除及对亚硝胺合成的阻断作用。

1材料与方法

1.1材料、仪器及试剂

1.1.1材料兴安杜鹃叶和茎样品，采于伊春市汤旺河林场。

1.1.2仪器与试剂TU-1800SPC型紫外可见分光光度计。芦丁标准品（美国SIGMA公司），其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1总黄酮含量的测定采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法［3］。以芦丁为标准品，以95%乙醇为溶剂，精确配制芦丁标准溶液0.020、0.040、0.060、0.080、0.100 g/L，测定各溶液的OD510 nm。

分别称取2 g兴安杜鹃叶和茎样品，以95%（V/V）乙醇为浸提液，采用超声波提取法浸提，浸提液体积（mL）与样品质量（g）比为10∶1，在30 ℃时浸提3次，每次浸提30 min。合并浸提液，定容至100 mL。测定样品溶液的OD510 nm。

1.2.2对·OH清除作用的测定对·OH清除作用的测定方法采用水杨酸法［8］。分别称取2 g兴安杜鹃叶和茎样品， 95%乙醇超声浸提，定容至100 mL待用。各取样品溶液1、2、3、4、5 mL，体系中分别加入10 mmol/L FeSO4溶液1 mL，5 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL， 3 % H2O2溶液2 mL，定容至10 mL。37 ℃恒温反应30 min，510 nm处测定吸光度。以95%乙醇、3% H2O2溶液作为空白溶液，测定吸光度。根据所测样品吸光度（Am）及空白溶液吸光度（A0），以对 ·OH的清除率E来衡量试样的抗氧化能力。清除率计算公式：

E=■×100% （1）

1.2.3对亚硝酸盐清除作用的测定对亚硝酸盐清除作用的测定方法采用重氮偶合比色法［9］。分别称取2 g兴安杜鹃叶和茎样品， 95%乙醇超声浸提，定容至100 mL，待用。各取样品溶液1、2、3、4、5 mL，体系中分别加入5 mg/L NaNO2溶液2 mL，37℃恒温反应20 min。加入0.4%（m/V，下同）的氨基苯磺酸2 mL，静置5 min，再加入0.2%（m/V，下同）盐酸萘乙二胺1 mL，定容至10 mL。静置15 min，540 nm处测定吸光度。以NaNO2溶液作为空白溶液。按公式（1）计算清除率。

1.2.4 对亚硝胺合成阻断作用的测定对亚硝胺合成阻断率的测定方法采用紫外光解法［9］。分别称取2 g兴安杜鹃叶和茎样品， 95%乙醇超声浸提，定容至100 mL待用。各取样品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL，体系中分别加入pH为 3.1的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液10 mL，1 mmol/LNaNO2溶液1 mL，1 mmol/L二甲胺溶液1 mL，去离子水定容至25 mL，37℃恒温反应1 h，获得亚硝胺溶液。取1 mL亚硝胺溶液，加入0.5%的Na2CO3溶液1 mL，在紫外灯下照射15 min，再加入1%对氨基苯磺酸溶液1.5 mL， 0.1%的1-萘胺溶液1.5 mL。静置15 min，525 nm处测定吸光度。以去离子水代替样品溶液做空白对照，合成阻断率计算公式同上。

1.2.5对超氧阴离子清除作用的测定对超氧阴离子清除作用的测定方法采用邻苯三酚法［8］。称取2 g兴安杜鹃叶样品， 95%乙醇超声浸提，定容至100 mL待用。各取样品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，体系中分别加入pH 为8.2的Tris-HCl缓冲溶液4 mL，定容至9 mL。37℃恒温20 min，然后加入同温度1 mmol/L邻苯三酚溶液1 mL，反应5 min，325 nm处测定吸光度，以去离子水作为空白溶液。按公式（1）计算清除率。

1.2.6 VC对清除反应的协同作用测定方法用1 mL 0.02%VC溶液代替兴安杜鹃样品溶液，重复以上步骤，测定吸光度，计算清除率。取样品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别与1 mL 0.02%VC溶液混合，测定吸光度，计算清除率。考察VC对清除反应的协同作用。

2结果与分析

2.1 对·OH和亚硝酸盐的清除作用

兴安杜鹃总黄酮对·OH和亚硝酸盐的清除作用如表1所示。由表1可知，兴安杜鹃提取物对·OH和亚硝酸盐均有清除作用。随着总黄酮浓度的增大，清除作用增强。通过线性回归分析，对·OH的清除率达到50%所需提取物总黄酮浓度分别为叶18.5 mg/L，茎22.5 mg/L。对亚硝酸盐的清除率达到50%所需提取物总黄酮浓度分别为叶17.8 mg/L，茎23.3 mg/L。兴安杜鹃叶对·OH的清除作用强于茎的清除作用。

2.2 对亚硝胺合成的阻断作用

兴安杜鹃提取物对亚硝胺合成的阻断作用结果如表2所示。由表2可以看出，兴安杜鹃提取物对亚硝胺的合成具有阻断作用。随着提取物总黄酮浓度的增大，亚硝胺合成的阻断作用增加。通过线性回归分析，对亚硝胺合成的阻断率达到50%所需提取物总黄酮浓度分别为叶8.8 mg/L，茎10.8 mg/L。兴安杜鹃对叶亚硝胺合成的阻断作用强于茎的合成阻断作用，相对而言，叶和茎提取物的对亚硝胺合成阻断作用无显著差异。

在提取物浓度较小时，兴安杜鹃提取物的阻断率已经超过40%，说明兴安杜鹃提取物对亚硝胺的合成的阻断作用强于其对·OH和亚硝酸盐的清除作用。

2.3对超氧阴离子的清除作用

兴安杜鹃提取物对超氧阴离子的清除作用及VC对清除反应的协同作用如表3。由表3可以看出，兴安杜鹃叶提取物对超氧阴离子有清除作用。随着提取物总黄酮浓度的增大，清除作用增加。通过线性回归分析，对超氧阴离子的清除率达到50%所需提取物总黄酮浓度为叶8.2 mg/L。VC对清除反应有协同作用。兴安杜鹃提取物浓度较低时，VC对清除反应的协同作用更为明显，随着提取物总黄酮浓度上升，协同作用降低。

总黄酮对多种自由基均有清除作用，原因是总黄酮通过其分子中的多个羟基与自由基反应，生成稳定的半醌式物质而终止自由基的链反应［1０］。总黄酮的抗氧化活性与羟基的位置和数目有关，但主要取决于羟基的相对位置，而一般情况下，酚羟基数目越多，抗氧化能力越强［6］。具有色原酮结构的黄酮2、3位上不饱和双键也会在一定程度上增强其抗氧化活性。与金属离子的络合也是黄酮阻止自由基氧化的途径之一。黄酮类物质在抗氧化反应中，不仅可以清除引发链反应的活性自由基和起催化作用的金属离子，还能直接捕捉链传递阶段的过氧自由基，阻断链反应，是优良的阻断型抗氧化剂［10］。

3结论

兴安杜鹃提取物对·OH、亚硝酸盐和超氧阴离子均有清除作用，对亚硝胺的合成具有阻断作用。随着浓度的增大，清除作用或合成阻断作用增加，两者之间存在着量效关系。相比之下，兴安杜鹃提取物对超氧阴离子的清除效果优于对·OH和亚硝酸盐的清除效果，兴安杜鹃叶提取物的清除作用强于茎提取物的清除作用，相对而言，叶和茎提取物的清除作用无显著差异。兴安杜鹃具有抗氧化活性，可以作为天然抗氧化剂进行开发应用。

参考文献：

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［3］孙墨珑，惠宇，王珊珊．兴安杜鹃总黄酮质量分数及提取物稳定性［J］．东北林业大学学报，2010，38（9）：84-85．

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