复方龙星片质量标准研究*

徐光临，易 月，刘 力，徐德生

（上海中医药大学附属曙光医院药剂科，上海 200021）

复方龙星片处方来源于全国名老中医黄吉庚教授的经验方，由地龙、黄芩、制南星、干姜组方，具有清热化痰、平喘止咳之功效，临床用于咳嗽、气喘偏痰热型者，急慢性支气管炎、哮喘辨证偏热型者。复方龙星片作为医院制剂在本院临床应用已近20年，疗效确切，具有较强的进一步开发为新药的可行性。文献报道地龙中次黄嘌呤[1－2]的平喘作用与黄芩中黄芩苷[3－4]的抗炎作用与复方龙星片的功效吻合，确为其中的有效成分。笔者采用薄层色谱（TLC）法对方中地龙、黄芩进行了定性鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法分别对次黄嘌呤及黄芩苷进行了含量测定，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪（四元泵，美国安捷伦科技有限公司）；薄层层析用硅胶（青岛海洋化工厂）；（CQX25－06型超声波清洗器(上海必能信超声有限公司，500 W，33 kHz）；分析天平（上海天平仪器厂）；DL－8R型冷冻离心机（上海市离心机械研究所）。地龙对照药材(批号200405)、亮氨酸对照品(批号9701)、缬氨酸对照品(批号9701)、黄芩苷对照品(批号201117)、次黄嘌呤对照品(批号200402)，均购自中国药品生物制品检定所；地龙、黄芩饮片（徐重道中药饮片有限公司）；复方龙星片(医院自制 ，沪 药 制 字 Z05100130，0.3 g／片 ，批 号 100415，100715，110223，110427，110916，130326）；液相用甲醇、乙腈为色谱纯，双蒸水（医院自制），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别(TLC法)

2.1.1 地龙

取复方龙星片适量，研细，称取1 g，加水10 mL，加热至沸，冷却，离心，取上清液作为供试品溶液。取地龙饮片、中间品和缺地龙的阴性片各1 g，同法制成地龙饮片、中间品和阴性对照品溶液。另取地龙对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取亮氨酸、缬氨酸对照品，加水制成每1 mL各含 1 mg和0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法[2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验，吸取上述溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇 －冰醋酸 －水（4∶1 ∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品、中间品及饮片溶液色谱中，在与对照药材溶液及对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，缺地龙的阴性对照品溶液对鉴别无干扰。结果见图1。

2.1.2 黄芩

取复方龙星片适量，研细，称取1 g，加甲醇 10 mL，超声 1 h，滤过，滤液浓缩至5 mL，作为供试品溶液。另取中间品、缺黄芩的阴性片各1 g，黄芩饮片0.5 g，同法制成中间品、阴性对照品、黄芩饮片溶液。再取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照 TLC法[2010年版《中国药典（一部）》附录Ⅵ B]试验，吸取供试品、中间品、黄芩饮片和阴性对照品溶液各6 μL以及黄芩苷对照品溶液2 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯－丁酮 －甲酸－水（5∶3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试中间品及黄芩饮片溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上均显相同颜色的斑点，缺黄芩的阴性对照品溶液对鉴别无干扰。结果见图 2。

图1 地龙薄层色谱图

图2 黄芩薄层色谱图

2.2 次黄嘌呤含量测定(HPLC法)

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：迪马 Diamonsil C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：水 － 甲醇 － 乙腈（98.8 ∶0.6 ∶0.6）；流速：1.0 mL ／min；柱温：25℃；检测波长：248 nm。按上述色谱条件，分别吸取次黄嘌呤对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL检测。结果见图3。可见，供试品溶液色谱中次黄嘌呤达到基线分离，阴性对照品溶液中无相应色谱峰。

表1 次黄嘌呤加样回收试验结果（n＝9）

2.2.4 样品含量测定

分别取不同批号的复方龙星片，依法测定。结果见表2。

图3 次黄嘌呤高效液相色谱图

表2 样品含量测定结果(标示量的%)

2.2.2 溶液制备

取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含0.206 mg的高质量浓度对照品溶液；精密量取高质量浓度对照品溶液2 mL，置 5 mL容量瓶中，50%甲醇定容，制成每 1 mL含0.082 3 mg的中质量浓度对照品溶液；精密量取高质量浓度对照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，50%甲醇定容，制成每1 mL含0.020 6 mg的低质量浓度对照品溶液。将复方龙星片研细，取约0.25 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入 50%甲醇50 mL，超声 30 min，于 4 000 r／min 转速，离心 20 min，上清液减压浓缩并转移至10 mL容量瓶，50%甲醇定容，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液即得供试品溶液。按生产工艺制备方法制备缺地龙的阴性对照品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取对照品溶液低质量浓度1，10 μL，中质量浓度 2，10 μL，高质量浓度 5，10 μL 注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标 Y、进样量 X（μg）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y＝4 595.5 X＋13.859，r＝0.999 95（n ＝6）。结果表明，次黄嘌呤进样量在 0.020 6 ～2.06 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：取次黄嘌呤对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL。结果峰面积积分值的 RSD为1.3%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取次黄嘌呤对照品溶液及供试品溶液，于12 d内分多次进样，每次进样10 μL，测定峰面积。结果的 RSD分别为0.079%和1.35%，表明溶液在12 d内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号130326）样品6份，依法制备供试品溶液，测定含量。结果次黄嘌呤平均含量为0.066%，RSD为1.50%，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号130326）约0.125 g，精密称定，共9份，分别加入约1.2倍、1倍、0.8倍样品含量的次黄嘌呤对照品溶液，每个质量浓度平行3份，按供试品溶液制备方法制备溶液，进样10 μL，测定含量，计算回收率。结果见表1。

2.3 黄芩苷(HPLC法)含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：迪马 Diamonsil C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 － 水 － 磷酸（47 ∶53 ∶0.2）；流速：1.0 mL ／min；柱温：25℃；检测波长：280 nm。按上述色谱条件，分别吸取黄芩苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各5 μL进样检测。结果见图4。可见，供试品溶液色谱中黄芩苷达到基线分离，阴性对照品溶液中无相应色谱峰。

2.3.2 溶液制备

取黄芩苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含0.130 8 mg的高质量浓度对照品溶液；精密量取高质量浓度对照品溶液5 mL，置10 mL容量瓶中，70%乙醇定容，制成每1 mL含0.065 4 mg的中质量浓度对照品溶液；精密量取高质量浓度对照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，70%乙醇定容，制成每1 mL含0.013 08 mg的低质量浓度对照品溶液。将复方龙星片研细，取约0.25 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加入70%乙醇50 mL，水浴加热，回流30 min，过滤，滤液转移至100 mL容量瓶，70%乙醇定容，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按生产工艺制备方法制备缺黄芩的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取对照品溶液低质量浓度5 μL，中质量浓度 5，10，15 μL，高质量浓度 10，15 μL 注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标 Y、进样量 X（μg）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y＝3 408.5 X＋15.979，r＝1.000 0（n＝6）。结果表明，黄芩苷进样量在 0.065 4～1.962 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：取黄芩苷对照品溶液，连续进样6次，每次进样5 μL。结果峰面积积分值 RSD为0.3%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取黄芩苷对照品溶液、供试品溶液，于24 h内分多次进样，测定黄芩苷峰面积。结果 RSD分别为0.99%和0.60%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号130326）样品6份，依法制备供试品溶液，测定黄芩苷含量。结果平均含量为4.55%，RSD为1.09%(n ＝6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为130326）约0.1 g，精密称定，共9份，分别加入约1.2倍、1倍、0.8倍样品含量的黄芩苷对照品，每个质量浓度平行3份，按供试品溶液制备方法制备溶液，进样5 μL，测定含量，计算回收率。结果见表3。

表3 黄芩苷加样回收试验结果（n＝9）

2.3.4 样品含量测定

分别取不同批号的复方龙星片，依法测定。结果见表2。

3 讨论

流动相选择：次黄嘌呤含量测定中曾参考水－甲醇－四氢呋喃[5]系统，考虑四氢呋喃的毒性，为尽量避免使用，同时简化流动相配制操作，用液相常用试剂乙腈替代，改为水－甲醇－乙腈系统，通过对水－甲醇－乙腈比例的考察，流动相确定为水－甲醇－乙腈（98.8 ∶0.6 ∶0.6）。

样品提取方法和时间选择：次黄嘌呤含量测定时，样品处理方法溶剂考察了50%甲醇和双蒸水，结果次黄嘌呤提取率双蒸水比50%甲醇略高，因地龙中含有较多蛋白质，并色谱柱使用寿命角度考虑，选择50%甲醇为提取溶剂；超声0.5 h与加热回流0.5 h的提取率相同，且超声提取0.5 h，1 h次黄嘌呤提取率差异不明显，故确定为超声提取0.5 h。黄芩苷含量测定中，样品处理方法溶剂考察了甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇，结果70%乙醇中复方龙星片黄芩苷含量最高；提取方法考察了加热回流和超声提取，结果加热回流法中黄芩苷的提取率较高；提取时间考察了回流 0.5，1，1.5 h，结果黄芩苷的提取率并无明显差别，回流时间选择 0.5 h。

本试验中所建立的定性及定量方法，简单、快捷、准确，能有效控制复方龙星片的质量。

[1]张理平，李如辉.地龙药理研究与临床应用的概况[J].福建中医药，1990，21（6）：52.

[2]木海鸥，苏孝共.地龙的药理研究概要[J].中国药业，2007，16（1）：61－62.

[3]蒋 韵，吴芬芬，刘 桦，等.黄芩甙抗过敏机制的药理研究[J].中国实验临床免疫学杂志，1995，7（3）：7 － 10.

[4]雷 芳 .黄芩苷药理作用研究进展[J].中国药业，2010，19（15）：88.

[5]卢绮雯，李 坚，何 琳.高效液相色谱法测定不同产地广地龙配方颗粒中次黄嘌呤的含量[J].时珍国医国药，2007，18（9）：2 200 －2 201.?