高效液相色谱法测定清热化毒丸中连翘苷的含量

郑琰+刘淑华

[摘要] 目的 建立高效液相色谱法测定清热化毒丸中连翘苷含量的方法。 方法 采用Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-水（26∶74）为流动相，检测波长为277 nm，流速为1.0 ml/min。 结果 连翘苷进样量在0.2124～5.3100 μg （r=0.9994）线性范围内，线性关系良好，平均回收率为98.46%，RSD=0.86%（n=6）。 结论 该方法准确、重复性好，可用于清热化毒丸的质量控制。

[关键词] 清热化毒丸；连翘苷；高效液相色谱法

[中图分类号] R286.0[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）04（c）-0061-02

The content of phillyrin of Qingre huadu wan determined by high performance liquid chromatography

ZHENG Yan LIU Shu-hua

Institute for Food and Drug Control of Chaoyang City in Liaoning Province,Chaoyang 122000,China

[Abstract] Objective To establish the method of high performance liquid chromatography (HPLC) determining the content of phillyrin of Qingre huadu wan. Methods Hypersil C18（4.6 mm×250 mm,5 μm） chromatographic column was used.The mobile phase cinsisted of acetonitrile-water (26∶74),the detection wavelength was 277 nm and the flow rate of 1.0 ml/min. Results Phillyrin sample volume showed good linear relationship in the range of 0.2124-5.3100 μg (r=0.9994);the average recovery rate was 98.46%,RSD=0.86% (n=6). Conclusion The method is accurate with a good reproducibility,and suitable for quality control of Qingre huadu wan.

[Key words] Qingre huadu wan;Phillyrin;High performance liquid chromatography

清热化毒丸是由连翘、青黛、黄芩、黄连、菊花、犀角粉等16味药炼制而成，收载于原卫生部药品标准·中药成方制剂第二册，具有清火化毒，消肿止痛的作用，主要用于小儿身热烦躁，咽喉肿痛，口舌生疮，皮肤疮疖，口臭，便秘等。原标准中只有薄层色谱法进行定性分析，而文献资料只有对黄连、黄芩之类的质量分析，没有针对连翘苷的定量分析，药理实验表明，连翘苷具有较强的抗病毒、强心、抗肝损伤性等活性，为了有效地控制药品的内在质量，笔者故建立对连翘苷的高效液相色谱测定法（HPLC）[1-4]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪；Waters2489紫外检测器；Waters Empower色谱工作站。BP 211D电子分析天平（德国赛多利斯公司），9860 A型超声仪（费纳米科技发展有限公司）。

1.2 试药

连翘苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110821-201112）；清热化毒丸（辽宁仙草堂药业股份有限公司，批号：130901，130301，130501）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 Hypersil C18（4.6 mm×250 mm；5μm）；流动相：乙腈-水（26∶74）；流速：1.0 ml/min；柱温：28℃；波长：277 nm；理论板数：按连翘苷计算≥3000[5-9]。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取连翘苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备取清热化毒丸，剪碎，精称15.0 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，密塞，冷浸过夜，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量 摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备取除连翘外的其他药材，按所确定的工艺生产阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验取阴性供试品溶液、对照品溶液、供试品溶液各10 μl，依法分别注入液相色谱仪，在连翘苷对照品色谱相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性对照品溶液在此处无干扰，表明其他组分对测定无干扰（图1）。

a.对照品溶液；b.供试品溶液；c.阴性对照溶液；1.连翘苷

图1 HPLC色谱图

2.3.2 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液1、5、 10、15、20、25 μl注入液相色谱仪，依法测定连翘苷的峰面积。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=39029X+14747，r=0.9994，结果表明，连翘苷对照品进样量在0.2124～5.3100 μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验取供试品（批号130901），精密称取15.0 g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液。精密吸取10 μl，连续进样6次，测定色谱峰面积的RSD为0.38%，结果表明，仪器的精密度良好。

2.5.4 重复性试验取同一批号（130901）样品6份，分别精密称取15.0 g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，分别进样分析，测定连翘苷的含量，结果平均含量为0.1024 mg/g，RSD为1.3%，结果表明，该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、 8、12 h时分别进样10 μl，分别进样分析，结果连翘苷峰面积的RSD为0.28%，结果表明，供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验取已知含量的同批样品（批号130901，连翘苷含量为0.1024 mg/g）6份，每份7.5 g，精密称定，分别精密加入连翘苷对照品溶液（0.2124 mg/ml）3.5 ml，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，计算平均回收率，结果见表1。

表1 回收率试验测定结果

2.3.7 样品测定取3批样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，进样10 μl，采用外标法计算样品中连翘苷的含量，结果见表2。

表2 样品中连翘苷的测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 流动相选择

流动相选择时曾采用乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75）与乙腈-水（26∶74）进行比较实验，结果还是采用乙腈-水（26∶74）作为流动相，连翘苷能与其他杂质有较好的分离。

3.2 提取方法的考察

《中国药典》2010年版中采用的提到方法为上柱法，这种方法操作复杂，耗时长，而笔者采用的超声法操作比较简单，消耗的时间相对比较少，而这种方法重现好，样品与杂质也能够得到好的分离。

3.2 超声时间的选择

在20、30、40 min进行测定，结果提示，30 min时连翘苷已基本提取完全，故确定时间为30 min。

综上所述，本文建立了一种专属性强、简单快捷的定量方法，对连翘苷的质量控制有一定的参考作用。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中国药典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2010：284.

[2]卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）[Z].274.

[3]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社，2006：1552-1555.

[4]肖培根.新编中药志（第五卷）[M].北京：化学工业出版社，2007：797-802.

[5]史大军，邱海蕴，康红英.HPLC法测定清喉咽颗粒中连翘苷的含量[J].中国药事，2012，26（1）：57-58.

[6]孟和，朱艳红，吴学军.HPLC法测定保和丸中连翘苷的含量[J].中国药事，2013，27（3）：312-314.

[7]黄螺嘉，杨文红，郑剑红.HPLC法测定小儿感冒退热糖浆中连翘苷的含量[J].中草药，2004，35（7）：768.

[8]陆红柳，谭喜莹，赵陆华，等.连翘中连翘苷HPLC测定方法的改进[J].中草药，2007，38（6）：936-937.

[9]韩桂茹，庞国勋.连翘苷检测波长的研究[J].中国药品，2005，6（3）：71-73.

（收稿日期：2014-03-19本文编辑：许俊琴）

[摘要] 目的 建立高效液相色谱法测定清热化毒丸中连翘苷含量的方法。 方法 采用Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-水（26∶74）为流动相，检测波长为277 nm，流速为1.0 ml/min。 结果 连翘苷进样量在0.2124～5.3100 μg （r=0.9994）线性范围内，线性关系良好，平均回收率为98.46%，RSD=0.86%（n=6）。 结论 该方法准确、重复性好，可用于清热化毒丸的质量控制。

[关键词] 清热化毒丸；连翘苷；高效液相色谱法

[中图分类号] R286.0[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）04（c）-0061-02

The content of phillyrin of Qingre huadu wan determined by high performance liquid chromatography

ZHENG Yan LIU Shu-hua

Institute for Food and Drug Control of Chaoyang City in Liaoning Province,Chaoyang 122000,China

[Abstract] Objective To establish the method of high performance liquid chromatography (HPLC) determining the content of phillyrin of Qingre huadu wan. Methods Hypersil C18（4.6 mm×250 mm,5 μm） chromatographic column was used.The mobile phase cinsisted of acetonitrile-water (26∶74),the detection wavelength was 277 nm and the flow rate of 1.0 ml/min. Results Phillyrin sample volume showed good linear relationship in the range of 0.2124-5.3100 μg (r=0.9994);the average recovery rate was 98.46%,RSD=0.86% (n=6). Conclusion The method is accurate with a good reproducibility,and suitable for quality control of Qingre huadu wan.

[Key words] Qingre huadu wan;Phillyrin;High performance liquid chromatography

清热化毒丸是由连翘、青黛、黄芩、黄连、菊花、犀角粉等16味药炼制而成，收载于原卫生部药品标准·中药成方制剂第二册，具有清火化毒，消肿止痛的作用，主要用于小儿身热烦躁，咽喉肿痛，口舌生疮，皮肤疮疖，口臭，便秘等。原标准中只有薄层色谱法进行定性分析，而文献资料只有对黄连、黄芩之类的质量分析，没有针对连翘苷的定量分析，药理实验表明，连翘苷具有较强的抗病毒、强心、抗肝损伤性等活性，为了有效地控制药品的内在质量，笔者故建立对连翘苷的高效液相色谱测定法（HPLC）[1-4]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪；Waters2489紫外检测器；Waters Empower色谱工作站。BP 211D电子分析天平（德国赛多利斯公司），9860 A型超声仪（费纳米科技发展有限公司）。

1.2 试药

连翘苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110821-201112）；清热化毒丸（辽宁仙草堂药业股份有限公司，批号：130901，130301，130501）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 Hypersil C18（4.6 mm×250 mm；5μm）；流动相：乙腈-水（26∶74）；流速：1.0 ml/min；柱温：28℃；波长：277 nm；理论板数：按连翘苷计算≥3000[5-9]。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取连翘苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备取清热化毒丸，剪碎，精称15.0 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，密塞，冷浸过夜，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量 摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备取除连翘外的其他药材，按所确定的工艺生产阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验取阴性供试品溶液、对照品溶液、供试品溶液各10 μl，依法分别注入液相色谱仪，在连翘苷对照品色谱相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性对照品溶液在此处无干扰，表明其他组分对测定无干扰（图1）。

a.对照品溶液；b.供试品溶液；c.阴性对照溶液；1.连翘苷

图1 HPLC色谱图

2.3.2 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液1、5、 10、15、20、25 μl注入液相色谱仪，依法测定连翘苷的峰面积。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=39029X+14747，r=0.9994，结果表明，连翘苷对照品进样量在0.2124～5.3100 μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验取供试品（批号130901），精密称取15.0 g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液。精密吸取10 μl，连续进样6次，测定色谱峰面积的RSD为0.38%，结果表明，仪器的精密度良好。

2.5.4 重复性试验取同一批号（130901）样品6份，分别精密称取15.0 g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，分别进样分析，测定连翘苷的含量，结果平均含量为0.1024 mg/g，RSD为1.3%，结果表明，该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、 8、12 h时分别进样10 μl，分别进样分析，结果连翘苷峰面积的RSD为0.28%，结果表明，供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验取已知含量的同批样品（批号130901，连翘苷含量为0.1024 mg/g）6份，每份7.5 g，精密称定，分别精密加入连翘苷对照品溶液（0.2124 mg/ml）3.5 ml，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，计算平均回收率，结果见表1。

表1 回收率试验测定结果

2.3.7 样品测定取3批样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，进样10 μl，采用外标法计算样品中连翘苷的含量，结果见表2。

表2 样品中连翘苷的测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 流动相选择

流动相选择时曾采用乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75）与乙腈-水（26∶74）进行比较实验，结果还是采用乙腈-水（26∶74）作为流动相，连翘苷能与其他杂质有较好的分离。

3.2 提取方法的考察

《中国药典》2010年版中采用的提到方法为上柱法，这种方法操作复杂，耗时长，而笔者采用的超声法操作比较简单，消耗的时间相对比较少，而这种方法重现好，样品与杂质也能够得到好的分离。

3.2 超声时间的选择

在20、30、40 min进行测定，结果提示，30 min时连翘苷已基本提取完全，故确定时间为30 min。

综上所述，本文建立了一种专属性强、简单快捷的定量方法，对连翘苷的质量控制有一定的参考作用。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中国药典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2010：284.

[2]卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）[Z].274.

[3]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社，2006：1552-1555.

[4]肖培根.新编中药志（第五卷）[M].北京：化学工业出版社，2007：797-802.

[5]史大军，邱海蕴，康红英.HPLC法测定清喉咽颗粒中连翘苷的含量[J].中国药事，2012，26（1）：57-58.

[6]孟和，朱艳红，吴学军.HPLC法测定保和丸中连翘苷的含量[J].中国药事，2013，27（3）：312-314.

[7]黄螺嘉，杨文红，郑剑红.HPLC法测定小儿感冒退热糖浆中连翘苷的含量[J].中草药，2004，35（7）：768.

[8]陆红柳，谭喜莹，赵陆华，等.连翘中连翘苷HPLC测定方法的改进[J].中草药，2007，38（6）：936-937.

[9]韩桂茹，庞国勋.连翘苷检测波长的研究[J].中国药品，2005，6（3）：71-73.

（收稿日期：2014-03-19本文编辑：许俊琴）

[摘要] 目的 建立高效液相色谱法测定清热化毒丸中连翘苷含量的方法。 方法 采用Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-水（26∶74）为流动相，检测波长为277 nm，流速为1.0 ml/min。 结果 连翘苷进样量在0.2124～5.3100 μg （r=0.9994）线性范围内，线性关系良好，平均回收率为98.46%，RSD=0.86%（n=6）。 结论 该方法准确、重复性好，可用于清热化毒丸的质量控制。

[关键词] 清热化毒丸；连翘苷；高效液相色谱法

[中图分类号] R286.0[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）04（c）-0061-02

The content of phillyrin of Qingre huadu wan determined by high performance liquid chromatography

ZHENG Yan LIU Shu-hua

Institute for Food and Drug Control of Chaoyang City in Liaoning Province,Chaoyang 122000,China

[Abstract] Objective To establish the method of high performance liquid chromatography (HPLC) determining the content of phillyrin of Qingre huadu wan. Methods Hypersil C18（4.6 mm×250 mm,5 μm） chromatographic column was used.The mobile phase cinsisted of acetonitrile-water (26∶74),the detection wavelength was 277 nm and the flow rate of 1.0 ml/min. Results Phillyrin sample volume showed good linear relationship in the range of 0.2124-5.3100 μg (r=0.9994);the average recovery rate was 98.46%,RSD=0.86% (n=6). Conclusion The method is accurate with a good reproducibility,and suitable for quality control of Qingre huadu wan.

[Key words] Qingre huadu wan;Phillyrin;High performance liquid chromatography

清热化毒丸是由连翘、青黛、黄芩、黄连、菊花、犀角粉等16味药炼制而成，收载于原卫生部药品标准·中药成方制剂第二册，具有清火化毒，消肿止痛的作用，主要用于小儿身热烦躁，咽喉肿痛，口舌生疮，皮肤疮疖，口臭，便秘等。原标准中只有薄层色谱法进行定性分析，而文献资料只有对黄连、黄芩之类的质量分析，没有针对连翘苷的定量分析，药理实验表明，连翘苷具有较强的抗病毒、强心、抗肝损伤性等活性，为了有效地控制药品的内在质量，笔者故建立对连翘苷的高效液相色谱测定法（HPLC）[1-4]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪；Waters2489紫外检测器；Waters Empower色谱工作站。BP 211D电子分析天平（德国赛多利斯公司），9860 A型超声仪（费纳米科技发展有限公司）。

1.2 试药

连翘苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110821-201112）；清热化毒丸（辽宁仙草堂药业股份有限公司，批号：130901，130301，130501）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 Hypersil C18（4.6 mm×250 mm；5μm）；流动相：乙腈-水（26∶74）；流速：1.0 ml/min；柱温：28℃；波长：277 nm；理论板数：按连翘苷计算≥3000[5-9]。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取连翘苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备取清热化毒丸，剪碎，精称15.0 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，密塞，冷浸过夜，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量 摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备取除连翘外的其他药材，按所确定的工艺生产阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验取阴性供试品溶液、对照品溶液、供试品溶液各10 μl，依法分别注入液相色谱仪，在连翘苷对照品色谱相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性对照品溶液在此处无干扰，表明其他组分对测定无干扰（图1）。

a.对照品溶液；b.供试品溶液；c.阴性对照溶液；1.连翘苷

图1 HPLC色谱图

2.3.2 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液1、5、 10、15、20、25 μl注入液相色谱仪，依法测定连翘苷的峰面积。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=39029X+14747，r=0.9994，结果表明，连翘苷对照品进样量在0.2124～5.3100 μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验取供试品（批号130901），精密称取15.0 g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液。精密吸取10 μl，连续进样6次，测定色谱峰面积的RSD为0.38%，结果表明，仪器的精密度良好。

2.5.4 重复性试验取同一批号（130901）样品6份，分别精密称取15.0 g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，分别进样分析，测定连翘苷的含量，结果平均含量为0.1024 mg/g，RSD为1.3%，结果表明，该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、 8、12 h时分别进样10 μl，分别进样分析，结果连翘苷峰面积的RSD为0.28%，结果表明，供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验取已知含量的同批样品（批号130901，连翘苷含量为0.1024 mg/g）6份，每份7.5 g，精密称定，分别精密加入连翘苷对照品溶液（0.2124 mg/ml）3.5 ml，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，计算平均回收率，结果见表1。

表1 回收率试验测定结果

2.3.7 样品测定取3批样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，进样10 μl，采用外标法计算样品中连翘苷的含量，结果见表2。

表2 样品中连翘苷的测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 流动相选择

流动相选择时曾采用乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75）与乙腈-水（26∶74）进行比较实验，结果还是采用乙腈-水（26∶74）作为流动相，连翘苷能与其他杂质有较好的分离。

3.2 提取方法的考察

《中国药典》2010年版中采用的提到方法为上柱法，这种方法操作复杂，耗时长，而笔者采用的超声法操作比较简单，消耗的时间相对比较少，而这种方法重现好，样品与杂质也能够得到好的分离。

3.2 超声时间的选择

在20、30、40 min进行测定，结果提示，30 min时连翘苷已基本提取完全，故确定时间为30 min。

综上所述，本文建立了一种专属性强、简单快捷的定量方法，对连翘苷的质量控制有一定的参考作用。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中国药典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2010：284.

[2]卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）[Z].274.

[3]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社，2006：1552-1555.

[4]肖培根.新编中药志（第五卷）[M].北京：化学工业出版社，2007：797-802.

[5]史大军，邱海蕴，康红英.HPLC法测定清喉咽颗粒中连翘苷的含量[J].中国药事，2012，26（1）：57-58.

[6]孟和，朱艳红，吴学军.HPLC法测定保和丸中连翘苷的含量[J].中国药事，2013，27（3）：312-314.

[7]黄螺嘉，杨文红，郑剑红.HPLC法测定小儿感冒退热糖浆中连翘苷的含量[J].中草药，2004，35（7）：768.

[8]陆红柳，谭喜莹，赵陆华，等.连翘中连翘苷HPLC测定方法的改进[J].中草药，2007，38（6）：936-937.

[9]韩桂茹，庞国勋.连翘苷检测波长的研究[J].中国药品，2005，6（3）：71-73.

（收稿日期：2014-03-19本文编辑：许俊琴）