四溴双酚A和甲状腺素运载蛋白复合物的电喷雾质谱研究

王 献，王 朗

(中南民族大学 化学与材料科学学院， 武汉 430074)

近年电喷雾质谱广泛应用于蛋白质非共价复合物的研究[1-3]，其显著特点是蛋白质等生物大分子产生多电荷离子，使质荷比降至质谱仪的检测范围，使生物大分子的分析检测成为可能；另一方面电离过程是在大气压条件下的离子化室进行，离子化效率高，灵敏度高.电喷雾电离是一种软电离技术，可在离子化的过程中保持分子间较弱的非共价键作用，并直接提供蛋白质复合物重要的化学计量学信息，故电喷雾质谱是研究蛋白质多聚体和蛋白质复合物的有力工具[4-7].

甲状腺素运载蛋白(TTR)是一种同源四聚体蛋白，在生物体内主要由肝脏合成，分子量大约为55 Ku，在血液中主要运载甲状腺素(T4)，每个四聚体含有两个甲状腺素结合位点[8-10].四溴双酚A(TBBPA)是一种常用的溴代阻燃剂，广泛应用于各种家用、工业用品中.近年来，多种环境介质中均检测到四溴双酚A，且浓度逐年增加，四溴双酚A的环境毒理研究越来越受到研究者的关注[11-13].目前，关于四溴双酚A(TBBPA)的内分泌干扰毒理的研究报道较少[14,15]，有两种可能的毒理机制：一是四溴双酚A抑制三碘甲状腺原氨酸(T3，由T4脱碘生成)和甲状腺素受体的结合，干扰了生物体内甲状腺素的含量和生理效应；另一种可能是TBBPA在生物体内竞争性的结合到甲状腺素运载蛋白上，形成蛋白质复合物，干扰了甲状腺素的运输和正常的生理功能.本文通过电喷雾质谱法研究了四溴双酚A与甲状腺素运载蛋白的相互作用，检测出四溴双酚A可与甲状腺素运载蛋白四聚体形成稳定的摩尔比为1︰1、2︰1的蛋白质复合物，为上述第二种毒理机制提供了实验依据，有助于进一步的四溴双酚A毒理研究.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(Agilent 1200, 美国安捷伦科技有限公司)，电喷雾四极杆飞行时间质谱仪(Agilent 6520 ESI Q-TOF MS, 美国安捷伦科技有限公司)，高速冷冻离心机(GL-20M, 上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，超纯水机(Molelement 1815a摩尔元素型, 上海摩勒科学仪器有限公司)，数控超声波清洗器(KQ-25DB, 昆山市超声仪器有限公司).高精度数控摇床(SHZ-03,上海堪鑫仪器设备有限公司).

甲状腺素运载蛋白(来源于人类血浆, Sigma公司)，四溴双酚A(分析标准品, Aladdin公司)，二甲亚砜(DMSO)、冰醋酸(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司).

1.2 仪器条件

参考文献[16],1200液相系统自动进样器直接进样，流动相为超纯水(含体积比0.5‰的冰醋酸)，流速0.1 mL/min，进样体积1 μL.电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，一定的干燥气温度和裂解电压，干燥气流速11 L/min，雾化器压力206.7 kPa，毛细管电压3500 V，锥孔电压65 V，采集范围1000～4000 m/z.

1.3 TTR蛋白溶液的配制

甲状腺素运载蛋白用超纯水溶解，配成100 μmol/L的母液，四溴双酚A用DMSO溶解，配成100 mmol/L母液，置于冰箱中，4℃保存、备用.

用微量移液器取5 μL TTR母液，以pH 7.4的醋酸铵缓冲溶液为溶剂，将蛋白母液稀释至50 μL，得10 μmol/L的TTR稀释液，待测.将待测液置于离心机5000 g离心10 min，取上层液进ESI-MS检测.

1.4 TTR和TBBPA的孵育实验

用微量移液器取10 μL TTR蛋白母液，加入80 μL 10 mmol/L pH 7.4的醋酸铵缓冲液，10 μL 1 mmol/L的TBBPA溶液(由体积比为1︰1的DMSO、超纯水稀释TBBPA母液稀释100倍)，最终TTR浓度为10 μmol/L，TBBPA浓度为100 μmol/L，将混合液振荡、混匀，置于摇床37℃恒温水浴，孵育2 h.将孵育后的溶液置于离心机5000 g离心10 min，取上层液进ESI-MS检测.

2 结果与讨论

2.1 TTR蛋白的ESI-MS检测

TTR蛋白的ESI-MS检测发现，电喷雾离子源温度和裂解电压的升高有助于总体质谱信号的增强，但是会造成TTR四聚体的裂解，因此需要探索ESI条件以获得TTR最少裂解的最高质谱信号，并在这个条件下检测TTR与TBBPA形成的蛋白复合物.

2.1.1 电喷雾离子源温度的影响

电喷雾离子源中干燥气温度是质谱离子源部分重要的参数之一，合适的温度条件可较好地保持蛋白质的天然活性结构.图1是在不同干燥气温度条件下(裂解电压175V, 其他条件不变)得到的甲状腺素运载蛋白的电喷雾质谱图.图1中，高质荷比部分是TTR四聚体的多电荷峰，低质荷比部分是TTR单体多电荷峰.当温度为240℃时，由峰强可见其基本保持了甲状腺素运载蛋白的天然四聚体状态，仅有少部分蛋白解离为单体.当温度升高至270℃时，单体多电荷峰的强度明显增加，说明随着温度的增加，部分四聚体解离为单体.在300℃时，质谱检测到的几乎全是单体蛋白质峰，说明大多数四聚体蛋白质在高温下已解离为单体.

monomer: 单体; tetramer: 四聚体图1 不同干燥气温度下TTR的ESI-MS图Fig.1 The ESI-MS spectra of TTR at different drying gas temperatures

2.1.2 电喷雾离子源裂解电压的影响

电喷雾离子源部分的裂解电压是影响甲状腺素运载蛋白多电荷分布的重要因素之一.图2是在不同裂解电压条件下(干燥气温度240℃，其他条件不变)甲状腺素运载蛋白的电喷雾质谱图.由图2可见，当裂解电压为175 V时，所得基本为TTR四聚体多电荷峰，随着裂解电压的增加，TTR四聚体逐渐解离为单体.当裂解电压为325 V时四聚体几乎全部解离为单体.

图2 不同裂解电压下TTR的ESI-MS图Fig.2 The ESI-MS spectra of TTR at different fragmentor voltage conditions

2.2 TBBPA与TTR复合物的ESI-MS检测

选择合适的仪器条件是测定蛋白质复合物的关键，参考前述电喷雾质谱研究甲状腺素运载蛋白的各质谱参数，选择实验条件观察检测TBBPA-TTR蛋白质复合物的多电荷质谱峰.在较温和的温度、裂解电压等条件下虽能测得蛋白质复合物峰，但由于去溶剂效果不好，加合较多的水分子而令质谱图变宽，灵敏度降低.故优化实验条件，尤其是离子源部分的参数，以更好地脱去溶剂，保持蛋白质及其复合物的完整性.

图3是TTR和TBBPA孵育后在一定的干燥气温度和裂解电压条件下(其他条件不变)得到的电喷雾质谱图，由图3a可见原蛋白多电荷峰几乎消失，得到分别结合1个TBBPA和2个TBBPA的蛋白质复合物峰.图3b图说明了电喷雾质谱离子源条件对蛋白质复合物的影响.由图3b可见，随着温度的升高，结合2个TBBPA的蛋白质复合物大部分已解离，未结合TBBPA的TTR四聚体峰强度增加，并有部分四聚体解离为单体.但结合1个TBBPA的蛋白质复合物峰仍有较高的强度，说明该条件下结合1个TBBPA的蛋白复合物较稳定.

图3中TBBPA与TTR四聚体结合可得到不同摩尔比(1︰1, 2︰1)的蛋白质复合物.当TBBPA在生物体内累积到一定浓度时，可能与TTR蛋白形成复合物，干扰TTR对甲状腺素的运输，导致体内甲状腺素水平降低，引起甲状腺系统紊乱，表现出TBBPA的内分泌干扰毒性.

P: protein; L: ligand 图3 TTR和TBBPA蛋白复合物的ESI-MS图Fig.3 The ESI-MS spectra of TTR-TBBPA protein complex

3 结语

本文利用电喷雾质谱(ESI-MS)检测了甲状腺素运载蛋白及其和四溴双酚A形成的蛋白质复合物.在不同的质谱条件下，甲状腺素运载蛋白表现出不同的多电荷峰强度及分布，只有在较温和的干燥气温度或裂解电压条件下，才能获得较高峰强度的TTR四聚体的多电荷峰.四溴双酚A和甲状腺素运载蛋白形成的蛋白质复合物在不同的干燥气温度和裂解电压下，多电荷峰呈现出不同的峰强度，并能观察到摩尔比为1︰1和2︰1的蛋白质复合物峰.并证明了电喷雾质谱法在蛋白质复合物(蛋白多聚体及蛋白质-配体小分子复合物)研究中的突出优势.

参 考 文 献

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