循环miRNA检测在诊断急性冠脉综合征中的意义

许浩军，顾明，于宗良，谷惠敏，王炳芳

（江苏大学附属昆山医院心内科，江苏昆山215300）

循环miRNA检测在诊断急性冠脉综合征中的意义

许浩军，顾明，于宗良，谷惠敏，王炳芳

（江苏大学附属昆山医院心内科，江苏昆山215300）

目的：探讨循环miRNA检测在诊断急性冠脉综合征（ACS）中的意义。方法：选择100例ACS患者为研究组，匹配冠脉造影正常者100例为对照组，研究组再分为不稳定性心绞痛（UAP）组（n＝32）和急性心肌梗死（AMI）组（n＝68）。采用qRT-PCR方法检测血清miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499。结果：AMI患者的血清miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499水平较对照组显著增高，分别上调了4.15，4.46，7.95，6.62倍，UAP组较对照组也显著上升，分别上调了1.62，1.98，2.32，2.98倍，P均＜0.05。4种miRNA在AMI患者中的变化曲线均表现为发病时显著升高，发病后6 h最高，发病后24 h，72 h显著下降，并接近正常水平。miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499对AMI患者诊断的ROC曲线下面积分别为0.68，0.75，0.80，0.73，介于肌酸激酶同工酶和肌钙蛋白T之间。结论：循环特异性miRNA的水平升高可用于辅助诊断ACS。

急性冠脉综合征；miRNA；诊断

心血管疾病是威胁人类健康的重要疾病之一，其中急性冠脉综合征（ACS）是导致人类死亡的主要疾病。因此，早期、及时、准确的诊断及估计病情是积极采取有效的治疗措施并减少死亡率的必要条件［1］。生物标志物是辅助诊断ACS的重要工具。美国心脏病学会（ACC）与美国心脏病协会（AHA）在相关治疗指南［2］中推荐ACS患者在症状出现后6 h内检查心肌生化标志物，如肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌红蛋白和肌钙蛋白（cTn）等。上述标志物虽已在ACS患者早期诊断的敏感性及特异性上达到一定水平，但研究者们对高敏感性及特异性的新血清标志物的研究仍在继续，尤其是针对能反应ACS患者预后的良好血清标志物。近10年来新发现的非编码RNA——MicroRNA（miRNA）与各种疾病的发生和发展及预后有紧密联系。miRNA的表达不仅具有较好的组织特异性，且在血液中具有较高的稳定性，并已发现miRNA与心肌梗死的发生、发展有关，例如miR-1、miR-133、miR-208、miR-499等［3］，因此心肌特异性miRNA可能成为一种理想的生物学标志物用于ACS的早期诊断及判断预后。因此，本研究将分析ACS相关的循环miRNA，探讨其与不同类型ACS患者的关系，为ACS的诊断治疗提供帮助。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2012年2月至2013年2月于本院就诊的ACS患者100例为研究组，匹配冠脉造影正常者100例为对照组。研究组纳入标准：（1）年龄≥18岁且≤75岁。（2）ACS诊断符合2007年美国心脏病学会（ACC）和美国心脏协会（AHA）颁布的指南［2］，依据临床表现（心绞痛发作表现、心电图异常）及冠脉造影结果。（3）心肌梗死患者参照2007年心肌梗死诊断指南，心脏生物标志物水平升高超过参考值上限99百分位值，同时至少伴有下述心肌缺血证据之一：①缺血症状；②心电图提示新发缺血性改变；③影像学证据提示新发局部室壁运动异常或存活心肌丢失。对照组纳入标准：无心血管病史，心电图、胸片、肝肾功能、生化常规检查正常，排除合并感染、肿瘤等。排除标准：ACS患者并发其他脏器功能衰竭或严重病变（如肺癌、肝肾功能衰竭等）及过敏性疾病和自身免疫性疾病的患者除外。研究组男63例，女37例，平均年龄（46.43± 4.90）岁，对照组男62例，女38例，平均年龄（45.45 ±5.12）岁，两组年龄、性别分布差异无统计学意义，具有可比性。根据上述诊断标准将ACS组分为2个亚组：不稳定性心绞痛（UAP）组（n＝32）和急性心肌梗死（AMI）组（n＝68）。

1.2 样本收集和处理

UAP患者，采集随机静脉全血5 mL；AMI患者，及时采集入院后即刻、心肌梗死后6，24，72 h静脉全血5 mL，并记录血清肌钙蛋白T（cTnT）、CK-MB水平。抽取的外周静脉血置于不含抗凝剂的试管中，静置30min，室温3 000 r／min离心10 min，提取上清分装到去RNA酶的EP管中，再以12 000 r／min离心10 min，取上层血清每300μL分装至去RNA酶的EP管中，最后放置到－80℃低温冰箱中保存待用。

1.3 miRNA的检测

1.3.1 RNA提取及质检 依照miRNA提取试剂盒（Tiangen公司）说明，分别提取所有患者及对照血清样本中RNA，用于检测血清miR-1，miR-133a，miR-208b、miR-499水平，用紫外分光光度计检测样品的纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳分析提取质量。

1.3.2 反转录反应 配置反应液的过程在冰上进行，严格依据TaqManmicroRNA Assays（美国Applied Biosystems公司）说明书操作，将样品RNA反转录成cDNA（其中引物及探针序列由Applied Biosystems提供）。反应体系中试剂包括100 mmol／L dNTPs 0.15μL、MutiScribe逆转录酶（50 U／μL）1.0μL、10×反转录缓冲液1.5μL、RNA酶抑制剂（20 U／μL）0.19μL、无核酸酶水4.16μL、反转录引物3μL及RNA 5μL。

1.3.3 PCR反应 以cDNA为模板，使用TaqMan microRNA Assays中的PCR引物探针混合液进行PCR扩增及荧光定量检测，反应体系包括TaqMan 2 ×通用的PCR扩增预混试剂10μL、无核酸酶水7.67μL、PCR引物（20×）1.0μL及反转录产物（1∶15）1.33μL，共40个循环，实验重复3次。反应结束后分析PCR反应曲线，得到Ct值，即荧光达到阈值所需的PCR循环数。依据2－ΔΔCt法，计算每个患者miRNA水平的比例，以倍数表示。

1.4 统计方法

采用SPSS14.0软件进行统计分析，所有资料均采用中位数与四分位数间距（P25～P75）表示，计量资料之间的比较均采用秩和检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UAP、AMI患者发病时miRNA比较

图1为miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499在3组患者的血清水平比较。结果表明，AMI患者4种miRNA较对照组显著增高，分别上调了4.15，4.46，7.95，6.62倍（中位数，下同），UAP组较对照组也显著上调，分别上调了1.62，1.98，2.32，2.98倍，差异均有统计学意义。

2.2 miRNA在AMI发病时的变化及其与cTnT的诊断效能的比较

图2统计分析了miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499在AMI患者发病后血清水平的变化情况，4种miRNA均表现为发病时显著提升，发病后6 h最高，发病后24，72 h显著下降，并已接近正常水平。

表1统计并计算了miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499对AMI患者诊断的ROC曲线下面积，分别为0.68，0.75，0.80，0.73。而cTnT用于AMI诊断的ROC曲线下面积为0.83，CK-MB为0.65，可见miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499用于诊断AMI的诊断效能介于CK-MB和cTnT之间。

图1 各组患者发病时血清m iRNA水平比较

图2 AM I患者血清m iRNA水平的变化

表1 m iR-1、m iR-133a、m iR-208b和m iR-499对AM I患者的诊断效能

3 讨论

近年来，生物标志物对ACS等心血管疾病的早期诊断、治疗以及预后的判定、降低疾病死亡率起到了关键性的作用［4］。并且，临床医生合理选择理想的生物标志物对ACS的早期诊断、治疗以及预后判断等同样也起到关键作用［5］。

miRNA是一段长18～23个核苷酸的非编码RNA，具有负性调节基因表达的作用，有效地调控转录后翻译的效率以及靶mRNA的稳定性，在转录后水平沉默特定基因从而对基因表达起到精细调节的作用，调控细胞的生长、发育、分化和凋亡［6］。miRNA是许多重要生物过程的重要调节因子，在多种心血管疾病的发生发展中起重要作用。miRNA还存在于人循环血中，逐渐成为多种疾病的生物标志物。细胞内的miRNA主要通过两种途径进入循环系统，形成循环miRNA。第一种是从破裂细胞被动渗漏，如心肌梗死。第二种是源自细胞的微囊泡主动分泌。微囊泡可能是运输循环miRNA的主要载体，细胞内miRNA先被装入分泌囊泡中，然后伴随囊泡的分泌进入血液循环。由于循环miRNA存在于微囊泡的内部，避免了RNA酶的降解，因而具备一定的稳定性。并且循环miRNA能抵抗各种恶劣条件，包括煮沸、低或高pH值、延长贮存、冻融循环等［7］，因此，随着商品化的试剂盒的应用，循环miRNA的检测已十分可靠，可作为疾病的血清标志物。近年来已有大量研究表明循环miRNA与肿瘤、心血管疾病有关［8－9］，并已发现miRNA与心肌梗死有关，例如miR-1、miR-208、miR-499。Ai等［10］对心肌梗死患者采用实时定量PCR检测血浆miR-1水平，结果发现miR-1在心肌梗死急性期显著升高，2周后下降至基础水平。Wang等［11］对AMI患者和AMI模型大鼠心肌内miRNA的表达规律分析后发现，miR-208具备心脏特异性，在AMI时明显升高，但在正常心肌中无表达。最新研究发现［12－13］，miR-499在AMI后表达升高。D′Alessandra等［14］研究发现，miR-1，miR-133a，miR-133b和miR-499在心肌梗死患者及小鼠模型中显著增高，时间变化曲线与cTnI波动基本一致，即心肌梗死后数倍增高，24～48 h即可恢复正常。Corsten等［13］研究表明，miR-499与mir-208b在急性心肌梗死患者中较对照组显著上升，上升幅度与cTnI和肌酸磷酸激酶明显相关。本研究结果表明，AMI患者miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499的血清水平较对照组显著增高，分别上调了4.15，4.46，7.95，6.62倍，变化曲线均表现为发病后6 h最高，发病后24 h，72 h显著下降，并接近正常水平。miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499对AMI患者诊断的ROC曲线下面积分别为0.68，0.75，0.80，0.73，用cTnT诊断AMI的ROC曲线下面积为0.83，而CK-MB为0.65，可见4种miRNA用于诊断AMI的效能均能高于CK-MB，但仍然不及cTnT，进一步研究可通过多个miRNA联合诊断的方法提升诊断效率。

目前对ACS，尤其UAP中循环miRNA的研究才刚开始，许多结论尚有待进一步扩大样本量进行深入探讨，本研究结果初步表明循环miRNA的表达量对ACS的诊断具有一定的价值。

［1］Becker D，Merkely B.Acute coronary syndrome—2012［J］.Orv Hetil，2012，153（51）：2009－2015.

［2］Anderson JL，Adams CD，Antman EM，et al.ACC／AHA 2007 guidelines for the management of patients with unstable angina／non-ST-Elevation myocardial infarction：a reportof the American College of Cardiology／American Heart Association Task Force on Practice Guidelines（Writing Committee to Revise the 2002 Guidelines for the Managementof PatientsWith Unstable Angina／Non-ST-Elevation Myocardial Infarction）developed in collaboration with the American College of E-mergency Physicians，the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions，and the Society of Thoracic Surgeons endorsed by the American Association of Cardiovascular and Pulmonary Rehabilitation and the Society for Academic Emergency Medicine［J］.JAm Coll Cardiol，2007，50（7）：e1－e157.

［3］Matusik P，Guzik B，Weber C，et al.Do we know enough about the immune pathogenesis of acute coronary syndromes to improve clinical practice？［J］.Thromb Haemost，2012，108（3）：443－456.

［4］Crea F，Liuzzo G.Pathogenesis of acute coronary syndromes［J］.JAm Coll Cardiol，2013，61（1）：1－11.

［5］Ramasamy I.Biochemical markers in acute coronary syndrome［J］.Clin Chim Acta，2011，412（15／16）：1279－1296.

［6］Lindahl B.Acute coronary syndrome-the present and future role of biomarkers［J］.Clin Chem Lab Med，2013，23：1－8.

［7］Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseas［J］.Cell Res，2008，18（10）：997－1006.

［8］Allegra A，Alonci A，Campo S，et al.Circulating microRNAs：new biomarkers in diagnosis，prognosis and treatment of cancer（review）［J］.Int JOncol，2012，41（6）：1897－1912.

［9］Creemers EE，Tijsen AJ，Pinto YM.Circulating microRNAs：novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease？［J］.Circ Res，2012，110（3）：483－495.

［10］Ai J，Zhang R，Li Y，et al.CirculatingmicroRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391（1）：73－77.

［11］Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating microRNA：a novel potential biomarker for early diagnosis of acutemyocardial infarction in humans［J］.Eur Heart J，2010，31（6）：659－666.

［12］Adachi T，Nakanishi M，Otsuka Y，et al.Plasma microRNA 499 as a biomarker of acute myocardial infarction［J］.Clin Chem，2010，56（7）：1183－1185.

［13］Corsten MF，Dennert R，Jochems S，et al.Circulating MicroRNA-208b and MicroRNA-499 reflect myocardial damage in cardiovascular disease［J］.Circ Cardiovasc Genet，2010，3（6）：499－506.

［14］D′Alessandra Y，Devanna P，Limana F，etal.CirculatingmicroRNAs are new and sensitive biomarkers ofmyocardial infarction［J］.Eur Heart J，2010，31（22）：2765－2773.

Circulating m iRNA detection in the diagnosis of acute coronary syndrome

XU Hao-jun，GU Ming，YU Zong-liang，GU Hui-min，WANG Bing-fang

（Department of Cardiology，Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300，China）

Objective：To investigate the circulatingmiRNA detection in the diagnosis of acute coronary syndrome.M ethods：A total of 100 cases of ACSwere collected for the study group，and 100 subjects of normal coronary angiography werematched for the control group.The study group was further divided into unstable angina（UAP）group（n＝32）and acutemyocardial infarction（AMI）group（n＝68）.qRT-PCR was used to detect serum miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499.Results：Serum miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499 levels in AMIpatientswere significantly higher than the control group.They were increased 4.15，4.46，7.95，6.62 fold（median，the same below）.In UAP group，they were also increased significantly，1.62，1.98，2.32，2.98 fold compared with the control group respectively（P＜0.05）.Four kinds ofmiRNA in AMIpatients showed a change curve thatwas significantly improved after the onset of incidence，highest in 6 h and after the onset of24 h，72 h，decreased significantly and closed to the normal level.The area under the ROC curve ofmiR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499 in patients with AMI were 0.68，0.75，0.80，0.73，higher than CK-MB but lower than cTnT.Conclusion：Elevated levels of specific circulatingmiRNA can be used for the diagnosis of ACS.

acute coronary syndrome；miRNA；diagnosis

R541.4

A

1671－7783（2014）01－0059－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130224

许浩军（1976—），男，江苏昆山人，主治医师，主要从事冠心病临床及介入诊治；王炳芳（通信作者），博士，硕士生导师，主任医师，E-mail：shbingfang＠163.com

2013－10－07 ［编辑］何承志