不同年龄人群肌肉组织中7种线粒体酶的表达差异

Rukhsar Ahmad，蒋鹏程，顾韵，刘嫣方，陈芹，步雪峰，谢黎，林志强，钱炜

（江苏大学附属人民医院1.耳鼻喉科，2.普外科，3.中心实验室，江苏镇江212002）

不同年龄人群肌肉组织中7种线粒体酶的表达差异

Rukhsar Ahmad1，蒋鹏程2，顾韵1，刘嫣方3，陈芹3，步雪峰2，谢黎2，林志强1，钱炜1

（江苏大学附属人民医院1.耳鼻喉科，2.普外科，3.中心实验室，江苏镇江212002）

目的：探讨年轻人与中老年人肌肉中线粒体电子传递链和胞质中一些关键酶的表达差异。方法：收集7例年轻人及33例中老年人颈部肌肉标本，透射电镜观察两组肌肉中线粒体形态学变化，免疫组织化学染色和蛋白质印迹检测NADH氧化还原酶辅酶1［NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex 1，NDUFA1］，琥珀酸脱氢酶复合体铁硫亚基（succinate dehydrogenase complex，subunit B，SDHB），细胞色素b（cytochrome b，Cytb），细胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，COX），V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H），苹果酸脱氢酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短链羟烷基-辅酶A脱氢酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）的表达情况。结果：与年轻人相比，中老年人肌肉中线粒体体积增大，空泡增多，嵴排列紊乱，出现类结晶状包涵体；NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H表达量明显降低（P均＜0.05），但MDH及HADHSC的表达差异无统计学意义；蛋白质印迹结果与免疫组织化学结果相一致。结论：肌肉组织中线粒体的形态和关键酶的表达随年龄的增加出现明显改变，可能在衰老过程中起到重要作用。

衰老；肌肉；线粒体；酶

衰老是机体逐渐退化的过程，其重要特征就是骨骼肌质量逐渐丢失，肌肉力量逐渐降低［1－2］。人类一直不断地探索衰老的原因，早在20世纪50年代，Harman［3］就提出了衰老的自由基学说。在之后的几十年中，衰老的自由基理论逐渐延伸为衰老的线粒体学说［4］。线粒体在细胞的能量代谢中起着重要的作用，其通过内膜上大量的酶进行氧化磷酸化产生ATP，从而提供能量。骨骼肌中存在大量的线粒体，有研究显示肌肉衰老与线粒体功能下降之间存在着密切的关系［5］。尽管如此，线粒体电子传递中关键酶和胞质中某些重要酶在衰老肌肉中的表达变化仍不明确。本实验拟比较线粒体电子传递链中的关键酶和胞质中一些重要酶在年轻人与中老年人肌肉中的差异，探寻线粒体相关酶在衰老过程中的意义。

1 对象和方法

1.1 研究对象

收集2012年10月至2013年4月于江苏大学附属人民医院行甲状腺瘤切除术患者的颈部肌肉标本，共40例。根据世界卫生组织提出的年龄分段，其中，年轻患者（＜44岁）7例，女4例，男3例，年龄为26～39岁，中位33岁；中老年患者（＞45岁）33例，女20例，男13例，年龄为45～74岁，中位57岁。本研究方案获本院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 材料

兔抗人NADH氧化还原酶辅酶1［NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex 1，NDUFA1］、琥珀酸脱氢酶复合体铁硫亚基（succinate dehydrogenase complex，subunit B，SDHB）抗体及SABC免疫组化染色试剂盒购买于武汉博士德生物工程有限公司。兔抗人细胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，COX）抗体购于Cell Signaling生物技术公司。兔抗人细胞色素b（cytochrome b，Cytb）、V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H）抗体，鼠抗人苹果酸脱氢酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短链羟烷基 辅酶A脱氢酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）、β-肌动蛋白抗体购买于美国Santa Cruz公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购买于碧云天生物技术研究所。

1.3 透射电镜观察线粒体形态

手术中切除的新鲜肌肉标本立即切成1 mm3左右，5%戊二醛固定，送至南京医科大学分析测试中心应用透射电镜观察线粒体形态。

1.4 免疫组织化学染色

新鲜肌肉用4%甲醛固定，石蜡包埋。蜡块行4 μm切片，60℃烘烤30 min，二甲苯脱蜡，依次经100%，95%，85%，75%梯度乙醇水化，PBS洗2次，5min／次。用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭15min，蒸馏水洗3次。枸橼酸盐缓冲液（pH＝6.0）微波加热15 min进行抗原修复，冷却后PBS洗5 min。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min。甩去多余液体，滴加相应的一抗（NDUFA1，1∶100；SDHB，1∶100；Cytb，1∶100；COX，1∶1 000；VATPase H，1∶100；MDH，1∶100；HADHSC，1∶100），并用PBS作为空白对照，4℃过夜。PBS洗3次，5 min／次。滴加生物素化二抗，室温孵育20 min。PBS洗3次，5 min／次。滴加链霉亲和素 生物素 酶复合物试剂，室温孵育20 min。PBS洗5次，5 min／次。DAB显色（镜下掌握显色程度）。蒸馏水冲洗。苏木素复染1 min，盐酸乙醇分化。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片镜检。用Image J软件对切片进行图像分析，分析结果以平均灰度值作为统计指标。

1.5 蛋白质印迹分析

手术切除的新鲜肌肉切成小块之后加液氮研磨，RIPA裂解。BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白量一致后进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，5% BSA室温封闭1 h，然后加入相应的一抗，分别为NDUFA1，1∶100；SDHB，1∶100；Cytb，1∶200；COX，1∶1 000；V-ATPase H，1∶200；MDH，1∶200；HADHSC，1∶200；β-肌动蛋白1∶5 000，4℃过夜。TBST洗膜后加入HRP标记的相应种属的二抗，室温孵育1 h，ECL显色液化学发光检测。条带用LAND-1D进行灰度扫描。

1.6 统计学分析

用GraphPad Prism 5软件进行统计分析，所有实验至少重复3次。数据结果用均数±标准差（±s）表示。用t检验比较两组间差异，取95%可信区间。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肌肉标本线粒体形态比较

透射电镜结果显示，年轻人肌肉中线粒体由内、外两层单位膜包围而成，外膜较厚，内膜较薄，内膜向内折叠形成线粒体嵴，呈板层状排列。与年轻人相比，中老年人肌肉中线粒体体积变大，空泡增多，嵴排列紊乱，出现类结晶状包涵体，提示随着年龄的增加和机体的衰老，线粒体结构发生变化。见图1。

2.2 两组肌肉标本线粒体酶表达的变化

免疫组化检测结果显示，与年轻人肌肉相比，老年人肌肉中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX和V-ATPase H表达明显下降（P均＜0.05），而MDH和HADHSC两种酶的表达差异无统计学意义。见图2。

图1 两组肌肉标本线粒体结构（透射电镜×40 000）

图2 免疫组化法检测两组肌肉标本中7种线粒体酶的表达

2.3 蛋白质印迹检测线粒体酶表达

为验证免疫组织化学的结果，我们用蛋白质印迹法进一步检测两组肌肉中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H、MDH、HADHSC的含量。结果显示，与年轻人肌肉相比，中老年人肌肉中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX和V-ATPase H的表达明显降低（P均＜0.05），而MDH和HADHSC在两组中的表达差异无统计学意义，与免疫组织化学结果一致，见图3。

3 讨论

研究表明，衰老的发展过程与线粒体功能异常密切相关［6］。伴随电镜等技术的应用，线粒体的复杂结构已被全面认识。本研究结果显示，中老年人肌肉中的线粒体体积变大，空泡增多，嵴排列紊乱，出现类结晶状包涵体，失去了正常线粒体的结构，这些形态学上的异常变化与线粒体的功能障碍密切相关。因此，对线粒体超微结构的观察，是判断细胞衰老程度的重要指标［7－8］。

线粒体ATP的产生主要依靠电子传递链完成。电子传递链由NADH泛醌氧化还原酶（复合体Ⅰ）、琥珀酸泛醌氧化还原酶（复合体Ⅱ）、细胞色素C还原酶（复合体Ⅲ）、细胞色素C氧化酶（复合体Ⅳ）和ATP合酶（复合体Ⅴ）组成［9］。在线粒体呼吸链的电子传递过程中，电子的化学位能被复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ所利用，将基质中的质子泵到膜间隙中，最后质子通过ATP合酶回到基质中，其电化学势能被用来合成ATP分子。目前对于线粒体呼吸链酶复合体活性随衰老变化的研究较多，普遍认为大多数酶的活性随着年龄的增长而降低［10］，但是对于线粒体呼吸链酶表达变化的研究较少。我们通过对年轻人和中老年人肌肉中参与呼吸链构成的关键酶进行比较，发现大部分关键酶在衰老肌肉中表达下降，提示呼吸链关键酶的表达下调可能是衰老过程中线粒体酶活性降低的原因之一。因此，我们推测线粒体呼吸链酶表达下降导致线粒体呼吸链酶活性降低，从而导致线粒体功能受损，ATP生成减少，氧自由基生成增加，进而加速衰老进程。然而，也有研究显示线粒体呼吸链酶复合体蛋白水平并不随年龄发生明显的变化［11］，与我们的结果不一致。

图3 蛋白质印迹法检测两组肌肉标本中7种线粒体酶的表达

线粒体除了参与糖代谢提供能量以外，还参与一系列的细胞活动，包括脂肪酸的β氧化，磷脂的生物合成等，因此我们又对两组肌肉中MDH和HADHSC两种酶进行了比较。MDH是一个重要的涉及糖代谢的NAD＋依赖酶，定位于线粒体基质内，为基质标志酶，催化L-苹果酸和NAD＋形成草酰乙酸和NADH。研究显示，MDH在人类皮肤成纤维细胞的衰老中起到重要的作用［12］，衰老的成纤维细胞中MDH减少，敲除MDH会导致年轻成纤维细胞出现明显的衰老表现。然而我们的研究显示MDH在年轻人和中老年人肌肉中表达无明显差异，推测可能与上述报道中研究的组织不同有关。HADHSC也为线粒体的基质酶，以二聚体形式存在，参与脂类代谢，对于短链脂肪酸和中间产物的氧化至关重要，HASHSC缺陷与一系列代谢性疾病密切相关［13］。目前，关于HADHSC在衰老中的变化尚未见报道。本研究中该酶在年轻人与老年人肌肉中的表达差异无统计学意义，提示HADHSC可能与衰老的关系并不密切。

本实验利用透射电镜、免疫组织化学和蛋白质印迹方法检测年轻人和中老年人肌肉中线粒体电子传递链和胞质中一些关键酶的表达差异，结果表明线粒体这些关键酶的变化可能在衰老的过程中起到重要的作用。

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Differential expression of seven m itochondrial enzymes in young and old skeletalmuscles

Rukhsar Ahmad1，JIANG Peng-cheng2，GU Yun1，LIU Yan-fang3，CHEN Qin3，BU Xue-feng2，XIE Li2，LIN Zhi-qiang1，QIANWei1

（1.Department of Otolaryngology，2.Department of General Surgery，3.Central Laboratory，Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To study the relationship betweenmuscular function and ageing by comparing the morphologic and enzymatic expressions ofmuscularmitochondrion in differentage groups.M ethods：Specimens of neckmuscleswere collected from 7 young patients and 33 old patientswho underwentneck surgery.Themorphological changes ofmitochondrial were demonstrated by electronic microscope，whereas the expressions of NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex 1（NDUFA1），succinate dehydrogenase complex（SDHB），cytochrome b（Cytb），cytochrome c oxidase（COX），vacuolar-type H＋－ATPase（V-ATPase H），cytosolic malate dehydrogenase（MDH）and hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase（HADHSC）were detected by immunohistochemical staining and western blotting.Results：Compared with the young patients，themitochondria in elder patients became larger，and had more accumulating vacuoles，cristae abnormalities and intra-mitochondrial paracrystalline inclusions；meanwhile，the expressions of NDUFA1，SDHB，Cytb，COX，V-ATPase H decreased significantly in elder patients than young patients（both P＜0.05）.However，there was no difference in expression of MDH and HADHSC between young ___patients and old patients.These resultswere consistentwith western blotting.Conclusion：Themorphologicand enzymatic function ofmuscularmitochondria degenerated alongwith ageing，whichmight play an important role in ageing.

aging；muscle；mitochondrion；enzymes

R337.1；R339.38

A

1671－7783（2014）01－0022－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130265

江苏省六大人才高峰项目（2011-WSN021D）；江苏省医学科研招标立项课题（H201353）；镇江市科技支撑社会发展项目（SH2012042）

Rukhsar Ahmad（1986—），男，硕士研究生；钱炜（通讯作者），主任医师，硕士生导师，E-mail：dwqian＠yahoo.com

2013－11－27 ［编辑］刘星星