荧光原位杂交技术快速诊断胎儿染色体数目异常应用分析

刘宇仁 湖南省醴陵市妇幼保健院产前检查室 412200

新生儿中染色体出现异常的发生率近似为0.83%，其中大约一半新生儿因遗传物质总量变化而引起生长发育缓慢、智力下降、性发育异常以及畸形等临床表现［1］。近些年来国内通常采用血清学三联检查为诊断染色体异常的手段，与孕妇年龄及胎龄等标准结合筛选高危个例并给予产前诊断［2］。Klinger等学者［3］在1992年初次使用FISH技术直接检验未培养过的羊水细胞，产前诊断的时间显著缩短。目前由于FISH操作技术的简便性及稳定的性质逐渐引起广泛重视。本组研究采用FISH探针试剂盒快速检验1500例羊水标本的X、Y、21、18、13等5条染色体的数目。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为对本院2009年1月－2012年1月接受产前诊断的1500例孕妇，年龄20～46岁，平均年龄（30±1.8）岁，胎龄18～30周，平均胎龄（25±1.4）周。所有孕妇均在知情同意书上签字。进行检测的孕妇产前全部经唐氏筛查后概况：1500例产妇中，625例为21－三体综合征患者，占41.67%；272例为21－三体综合征并高龄产妇，占18.33%；16例为18－三体综合征并高危产妇，占1.07%；4例为18－三体综合征高危且高龄病患，占0.27%；5例21－三体综合征并18－三体综合征且均为高危者，占0.33%，其他（胎儿多出现畸形、近亲婚姻、分娩过21－三体综合征胎儿、夫妻两方染色体均异常、分娩过18－三体综合征胎儿）46例，占3.07%。

1.2 方法

1.2.1 穿刺羊膜：经彩色B超定位和指引，皮肤予消毒，于腹壁迅速进针，抽吸10ml羊水，存放于15ml无菌离心管内。

1.2.2 FISH检测：主要的设备和试剂见表1。

（1）FISH 探针：A组探针：GLP21（红色）探针为21q22区特异性探针；GLP13（绿色）探针为13q14区特异性探针。B组探针：CSPY（红色）探针为Y型染色体上着丝粒探针；CSPX探针为X型染色体上着丝粒探针，CSP探针为18号染色体上着丝粒探针。（2）FISH筛选步骤：①制备样品玻片：收集离心细胞，去掉上清液，胶原酶B水解，低渗KCL溶液温育，固定，去掉上清制备成悬浮液，滴片且老化。②预处理玻片：经SSC溶液清洗，胃蛋白溶液水解10min，再经SSC溶液清洗，于梯度酒精中脱水，自行干燥。③变性杂交：配备探针，离心后，于玻片杂交部位滴加10μl探针混合物，迅速盖上盖玻片，经橡皮胶密封边缘，75℃下共变性5min，42℃下杂交，放置过夜。④洗涤玻片：经SSC溶液和酒精漂洗。⑤复染：于避光处自行干燥，用DAPI复染剂进行复染，放置于避光处。（3）观察和判断FISH检测结果：随机计数羊水细胞超过50个，针对染色体正常细胞核，GLP21（红色）／GLP13（绿色）探针杂交后可观察到2个红色指示信号和2个绿色指示信号；CSPY（红色）／CSPX（绿色）／CSP18（湖蓝色）探针可观察到1个红色指示信号（男性）、1个绿色和2个湖蓝色指示信号，或者2个绿色指示信号、2个湖蓝色指示信号。评价标准：①正常：超过90%的细胞显示出正常类型的信号。②异常：超过60%的细胞显示出异常类型的信号。③无法判别：计数细胞增加至100个，判断最终结果。

表1 FISH检测所用的主要设备和仪器

2 结果

1500例孕妇经FISH技术检验其羊水细胞中X、Y、13、18、215种染色体，其中1462例胎儿染色体数目并无异常，38例胎儿染色体数目异常，其中27例胎儿诊断为21－三体综合征；6例为18－三体综合征；2例为13－三体综合征；1例为45，XO（特纳综合征）；1例47，XXY；1例47，XYY；见表2。所有FISH检测结果均符合经培养的羊水细胞染色体类型验证结果，21－三体经引产后脐血细胞染色体类型证实。

表2 FISH技术检测染色体异常结果

3 讨论

目前70%的先天性缺陷均由遗传物质引起，其中多见为染色体数目异常［4］。21－三体综合征（唐氏综合征）的临床表现主要为患儿智力降低、发育缓慢、面容特殊，伴随多发畸形，是一种较为普遍且严重的先天性智力低下疾病［5］。其次为Edward’s综合征，即18－三体综合征，临床主要的症状为常发畸形，新生儿娩出后数周夭折［6］。唐氏综合征胎儿平均生存时间仅为70d，幸存者存在智力低下、发育生长缓慢、畸形等异常情况［7］。性染色体（X和Y染色体）数目异常的普遍疾病为47，XXX（三倍体－X综合征）综合征、45，XO（特纳综合征）、47，XYY综合征以及47，XXY综合征等。目前尚无办法治疗染色体疾病，此病对整个家庭造成沉重的经济和精神压力，因此快速诊断胎儿染色体数目异常具有重要意义。

近些年来，国内多采用甲胎蛋白、游离雌三醇、人绒毛膜促性腺激素β亚单位三者联合的血清学筛选，结合产妇孕周及年龄初步诊断21－三体综合征和18－三体综合征，利用羊水细胞或者脐带血细胞的染色体分型验证为诊断的黄金准则。血清学检验费用低、速度快，临床上较为多用，然而其有假阳性高和假阴性高的缺陷［8］。培养羊水细胞需耗费较长时间，且易出现污染而造成培养失败，此外脐静脉的穿刺需具备较高的技术水准。因而，急切需要找到一种简单、方便，还能准确、快速诊断羊水细胞的科学技术以解决上述问题。在上个世纪末FISH技术顺势而生。这种技术利用直接或者间接经荧光标记的特异性DNA探针与目标细胞中相同序列的DNA杂交，可定量及定位分析目标DNA片段或者基因。鉴于每一种DNA探针仅能检验一种对应的DNA且显色，借助统计信号数目能够辨识对应染色体数目。与染色体类型检验比较，FISH技术具操作简单、检验快、特异性强、结果显著、成功率高、样本需要量少、诊断准确等优势，此外，FISH技术不仅能够检测分裂中期染色体，还可检测分裂间期染色体［9］。文献资料［10，11］提出其与染色体核型常规性分析结果的吻合率高达99.8%。本组分析结果检验出38例染色体遗传物质数量异常胎儿，其中27例胎儿诊断为21－三体综合征，占71.05%；6例为18－三体综合征，占15.79%；2例为13－三体综合征，占5.26%；性染色体数目异常分别为1例为45，XO（特纳综合征），占2.63%；1例47，XXY，占2.63%；1例47，XYY，占为2.63%。本文结果显示，诊断为染色体数量异常的胎儿中，21－三体综合征胎儿所占比例最大，其次为18－三体综合征胎儿，再者为13－三体综合征胎儿，符合临床染色体数目异常导致的疾病发病率。FISH检测纠正了单纯依赖于细胞遗传学进行诊断胎儿染色体数目异常的局限性和缺陷，防止了培养羊水细胞而导致的检查失败。本组对象中6例分娩过21－三体综合征胎儿的产妇，经FISH检测联合染色体类型验证，FISH筛选结果均无异常，染色体类型验证结果显示1例为染色体出现易位；2例夫妻两方自身染色体数目异常，或者分娩过染色数目异常胎儿的产妇，依旧要给予羊水细胞染色体类型验证，避免漏诊。

严重制约我国经济水平提高，影响人口素质的问题之一就是出生缺陷。因此，应高度重视对加大产前快速诊断胎儿染色体数目异常的研究、应用和推广。相比于常规羊水细胞或者脐带血细胞染色体类型验证结果，FISH技术有着操作简便、特异度高、灵敏性强、快速诊断等特征，满足临床实际工作的需求。综上所述，在产前快速诊断胎儿染色体数目的异常中应用荧光原位杂交技术，有较高的成功率和准确率，可在临床上予以推广应用。

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［8］唐新华，朱姝，苏洁，等.FISH技术快速诊断胎儿染色体数目异常〔J〕.中国妇幼保健，2010，25（26）：3810－3813.

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［10］吴清明，周瑾.FISH产前诊断非整倍体染色体病的应用分析〔J〕.中国优生与遗传杂志，2013，（9）：31－32.

［11］宋婕萍，王波，徐淑琴，等.荧光原位杂交技术在胎儿染色体非整倍体产前诊断中的应用〔J〕.实用医学杂志，2012，28（1）：111－113.