阴离子型胰蛋白酶原基因G191R突变与胰腺炎发病的关系

李璐 丁辉 杨玉秀 韩双印 王春荣

胰腺炎(pancreatitis)是由于各种因素刺激导致胰腺分泌多种消化溶解酶，引起胰腺及周围组织“自身消化”的炎症病变。急性胰腺炎(AP)以胰腺局部炎症反应为主要特征[1]，慢性胰腺炎(CP)以胰腺实质发生慢性持续性炎性损害、纤维化及可能导致的胰管扩张、胰管结石或钙化等不可逆的形态改变为特征[2]。目前胰腺炎的分子生物学机制尚未明确，近年来的研究表明多种基因可能参与胰腺炎的发生[3]。国外已有学者证实，阴离子型胰蛋白酶原(anionic trypsinogen，PRSS2)基因的G191R突变可以降低CP的易感性，具有保护作用[4-5]，但国内尚无相关报道。本研究采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)及DNA测序等技术分析胰腺炎患者PRSS2基因G191R突变情况，探讨其与胰腺炎发生的关系。

材料与方法

一、材料

研究对象为2010年5月至2012年12月郑州大学人民医院明确诊断的155例AP、CP的住院患者，诊断均符合《中国急性胰腺炎诊治指南(草案)》[1]及《慢性胰腺炎诊治指南》[6]的标准，同时随机选择138例无亲缘关系的健康体检者作为正常对照。155例中AP 82例，其中男性46例，女性36例，年龄36～57岁，平均51岁；CP 73例，其中男性44例，女性29例，年龄38～60岁，平均50岁。本研究获得医院伦理委员会批准，所有患者及体检者均签署知情同意书。

二、方法

1．DNA抽提：采用NaI提取法抽提外周血白细胞基因组DNA。取空腹外周血100 μl (EDTA抗凝)，加入Ep管中，10 000 r/min离心3 min，弃上清；加双蒸水200 μl，混匀后加6 mol/L NaI 200 μl，漩涡振荡20 s，加氯仿-异戊醇(24∶1)400 μl，混匀20 s，12 000 r/min离心12 min，上清移入新Ep管，加入0.6倍体积异丙醇，混匀后室温放置15 min，15 000 r/min离心12 min，加入70%乙醇1 ml，15 000 r/min离心12 min，弃乙醇，沉淀干燥后，加入1×TE缓冲液30 μl溶解DNA，-20℃保存备用。

2．巢式PCR：根据7号染色体(7p35)的基因组序列，选择PRSS2基因第4外显子前后的序列设计PRSS2基因G191R突变位点的第一次PCR扩增的引物，PRSS2e4-F1为5′-ATGGAGAACTTGCTATGATC-3′，PRSS2e4-R1为5′-GGTGTAGACTCCAGGCCTGT-3′。反应体积50 μl，其中模板DNA 50 ng，引物各20 pmo，dNTP 0.2 mmol/L，10×PCR缓冲液5 μl，Tap DNA酶2.0 U(Promega公司)。反应条件：95℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环，72℃ 7 min。首次PCR产物经1∶200稀释后取2μl作为模板进行第二次PCR。二次PCR反应的引物PRSS2e4-F2为5′-TTCCTGATCCTCACAGCCGA-3′，PRSS2e4-R2为5′-GACAAGTTGTATGAAGAGA G-3′。PCR反应体积和反应条件同首次PCR。

3．RFLP：反应体积20 μl，其中PCR产物6 μl，10×酶切缓冲液2 μl，Hpy188Ⅲ内切酶1U(NEB公司)，BSA 0.2 μl，无菌水11.8 μl。混匀后置37℃酶切产物 6 h，经2%琼脂糖凝胶电泳分离，摄片观察。

4．基因测序：第二次PCR产物用凝胶DNA回收试剂盒(Qiangen公司)回收、纯化，送上海生工生物技术有限公司测序。测序引物为PRSS2e4-F2。

三、统计学处理

采用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、PCR-RFLP

经二次PCR扩增出的野生型PRSS2基因片段为436 bp。G191R杂合性突变是使571位碱基由G→A，它可被限制性内切酶Hpy188Ⅲ切开(TCNNGA)形成309 bp和127 bp两个片段(图1)。

图1 PCR-RFLP电泳结果

二、DNA序列分析

测序确认PRSS2基因571位点上碱基存在G→A的错义突变(图2)。

图2 PRSS2基因G191R突变序列分析

三、数据分析

138名健康者中共检出PRSS2基因杂合性G191R突变12例，发生率为8.7%；82例AP患者共检出5例PRSS2基因杂合性G191R突变，发生率为6.1%，OR值为0.682,95%可信区0.231～2.010；73例CP患者中只检出1例PRSS2基因杂合性G191R突变，发生率为1.4%，OR值为0.145，95%可信区0.019～1.145。AP组与健康对照组间的差异无统计学意义(χ2=0.487，P=0.485)，而CP组与健康对照组间的差异具有统计学意义(χ2=4.432，P=0.035)。

讨 论

正常情况下，胰液内的胰蛋白酶原无活性，受到胰蛋白酶和肠激酶的激活后方具有消化能力。胰腺炎时因某些因素激活了胰腺内的胰蛋白酶，后者又激活了弹性硬蛋白酶及磷脂酶A等，造成弹性组织溶解、血管壁及胰腺导管损伤、胰腺细胞的溶解和坏死。人体胰液中共有3种胰蛋白酶原亚型：阳离子型胰蛋白酶(cationic trypsinogen, PRSS1)，约占2/3；阴离子型胰蛋白酶原(anionic trypsinogen, PRSS2)，约占1/3；中性胰蛋白酶原(mesotrypsinogen，PRSS3)，量很少[7]。

阴离子型胰蛋白酶原(PRSS2)基因位于7号染色体7p35，mRNA长度约3.6 kb，共包含5个外显子[8]，第191位甘氨酸位于第4外显子。PRSS2基因的G191R突变可形成一个对胰蛋白酶高度敏感的Arg191～Gly192肽键，水解产生N-(16～191位氨基酸)和C-(192～247位氨基酸)两个片段，其中C-水解片段含有酶活性至关重要的丝氨酸残基(Ser200)[4]。G191R突变使得PRSS2自我分解、发生不可逆性改变，从而降低了胰腺炎发病的攻击因素。本次研究发现，中国人PRSS2基因G191R突变在CP患者中的频率明显低于健康人，这与之前欧洲、日本及匈牙利人的研究相似[4-5，9]，支持G191R突变降低CP的易感性的观点。但Mahurkar等[10]报道，印度人G191R突变发生频率在慢性胰腺炎(0.7%)及健康人(0.3%)之间无显著差异，认为G191R突变对印度的CP患者没有保护作用。

本研究结果显示，PRSS2基因G191R突变在AP组与健康对照组间的差异无统计学意义，与欧洲及日本的研究结果基本一致[4-5]，表明AP的发生、发展与G191R突变无明显相关性。有研究报道，急性胆源性胰腺炎与IL-6多态性(174C/C)有关、AP时发生器官功能衰竭与TNF多态性(238G/A)有关[11]，重症急性胰腺炎的发生、发展与TLR4/NF-κB信号通路的激活有关[12]。

Kume等[5]的研究提示，自身免疫性胰腺炎G191R突变发生率与健康人相似，而酒精性和特发性慢性胰腺炎发生率较低。Rinderknecht等[13-14]提出慢性酒精中毒逆转PRSS1及PRSS2的比率，使PRSS2成为主要的胰蛋白酶原，从而增加G191R突变的影响，因此，G191R突变可能对慢性酗酒者有更好的保护作用。由于本次实验中搜集的病例数有限，无法按照病因等对胰腺炎患者进行详细的分类研究，因此尚需要大量的队列研究进一步阐明其与胰腺疾病的关系。

参 考 文 献

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