纤维原样蛋白2阳性表达预测急性胰腺炎病情的严重程度

怀佳萍 叶晓华 蔡振寨 陈燕萍

有学者认为，凝血机制的异常和血栓形成在重症急性胰腺炎(SAP)发病机制中占重要地位[1]，它最终可发展成弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[2]。纤维原样蛋白2(Fgl2)是一种新型的纤维蛋白原，表达于各种类型的细胞，在血栓的形成中发挥重要作用。它能激活凝血酶原酶，继而激发凝血系统，最终形成血栓，导致微循环障碍[3]。但Fgl2在SAP发病机制中的作用尚不清楚。本研究检测急性胰腺炎(AP)患者外周血单核细胞和胰腺组织中Fg12的表达，探讨其评估AP严重程度的临床应用价值。

一、材料和方法

1．标本收集：收集12例SAP、6例轻症急性胰腺炎(MAP)患者外周血，分离单个核细胞(PBMC)，以8名健康志愿者的PBMC作为对照。SAP及MAP的诊断符合中华医学会消化病分会胰腺病学组制定的标准。另收集2003年至2011年间15例行手术治疗的SAP患者的胰腺组织及11例胰腺癌手术时取的癌周胰腺组织，经病理检查证实为MAP的石蜡切片。

2．实时定量PCR：取分离得到的PBMC，应用Trizol抽提细胞总RNA，并逆转录成cDNA。引物序列： Fgl2上游为5′-CCTGGAGATTGTGGTTTCGT-3′，下游为5′-TACCATGCCTTTCTCCAAGG-3′； 内参β-actin上游为5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游为5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。 PCR反应条件：95℃ 15 s，60℃ 45 s， 72℃ 60 s，40次循环。根据反应曲线计算Ct值(Threshold Cycle)，采用公式2-ΔΔCt计算目的基因mRNA相对表达量。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。

3．免疫组化：采用Envision试剂盒检测外周单核细胞和胰腺组织的Fgl2表达。兔抗大鼠Fgl2多抗工作浓度为1∶100，最后DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，氨水反蓝，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。在200倍光镜下随机选取10个视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定其平均吸光度值，并进行半定量分析。

二、结果

1．外周血单核细胞Fgl2 mRNA及蛋白的表达：SAP组、MAP组、对照组PBMC的Fg12 mRNA相对表达量分别为2.13±1.00、1.02±0.36、1.00±0.08。SAP组PBMC的Fg12 mRNA表达显著高于MAP组及对照组，差异具有统计学意义(P值均<0.01)，而MAP组与对照组的差异无统计学意义。SAP组、MAP组、对照组的Fg12蛋白的相对表达量分别为1.65±0.91、0.87±0.54、0.79±0.1，SAP组PBMC的Fg12蛋白表达显著高于MAP组和对照组，差异有统计学意义(P值均<0.01)，而MAP组和对照组之间的差异无统计学意义(图1)。

图1 SAP组(a)、MAP组(b)、对照组(c)PBMC的Fgl2蛋白表达(免疫组化 ×200，)

2．胰腺组织Fgl2蛋白表达：SAP患者胰腺组织Fgl2高表达，主要表达于间质细胞和血管内皮细胞，MAP患者胰腺组织无明显Fgl2表达(图2)。SAP组、MAP组、对照组胰腺组织Fg12蛋白的相对表达量分别为2.19±1.12、0.71±0.43、0.86±0.19。SAP组胰腺组织Fg12蛋白表达量显著高于MAP组和对照组，差异有统计学意义(P值均<0.01)，而MAP组和对照组之间的差异无统计学意义。

图2 SAP组(a)、MAP组(b)胰腺组织Fgl2蛋白的表达(免疫组化×200，)

3．Fgl2表达与Ranson、APACHEⅡ评分的相关性：SAP患者的Ranson、APACHEⅡ评分分别为(3.64±1.19)、(10.88±2.28)分，MAP患者为(1.54 ±0.61)、(6.86±1.60)分，SAP患者较MAP患者显著升高，差异具有统计学意义(P值均<0.001)。SAP患者胰腺组织Fgl2表达量与SAP患者的Ranson、APACHEⅡ评分均呈正相关(r值分别为0.937、0.976,P值均<0.01)。

讨论SAP为一种炎症性疾病，在炎症过程中，纤维蛋白沉积导致的微血栓形成对病情的发展起重要作用[4]。Fgl2是一种新的促凝剂，能够通过其替代途径直接将凝血酶原转化为凝血酶，促进微血栓的形成[5]。 Fgl2主要表达于活化的巨噬细胞、T细胞和内皮细胞。

Fgl2启动的凝血途径是通过“免疫凝血”来实现的，表达于微血管内皮细胞、巨噬细胞和其他一些免疫细胞的Fgl2是由一系列促炎因子所介导的[6]。Clark等[7]报道，在TNF-α刺激下，滋养层和蜕膜层大量表达Fgl2，结果诱导CBA×DBA/2小鼠流产。

本研究结果显示，SAP组患者PBMC的Fg12 mRNA及蛋白的表达较MAP组和对照组显著上调，且主要定位于胰腺炎症区域所浸润的间质细胞和微脉管系统的内皮细胞。文献报道，Fgl2定位与纤维蛋白(原)的定位一致，表明Fgl2的表达可引起纤维蛋白沉积，导致微血栓形成，进而导致胰腺的病理损伤。虽然本研究采用的MAP组织是胰腺癌周围的胰腺组织，但Su等[6]报道肝癌组织及间质细胞均表达FgI2蛋白，故MAP组织未表达FgI2蛋白可排除假阴性的可能性。

通过spearman相关分析，PBMC的Fgl2表达与SAP患者入院24 h内Ranson、APACHEⅡ评分呈正相关，因此，检测PBMC的Fgl2的表达可能具有早期监测SAP严重程度的临床价值。此外，抗Fgl2抗体治疗或抗Fgl2基因疗法的有效性在MHC-3肝炎、移植排斥中也已得到证实[8]，可以减轻纤维蛋白的沉积和病理损伤，从而为胰腺炎的治疗提供新的靶点。

参 考 文 献

[1] Kakafika A, Papadopoulos V, Mimidis K, et al. Coagulation, platelets, and acute pancreatitis[J]. Pancreas, 2007, 34(1): 15-20.

[2] Yasuda T, Ueda T, Kamei K, et al. Plasma tissue factor pathway inhibitor levels in patients with acute pancreatitis[J]. J Gastroenterol, 2009, 44:1071-1079.

[3] Chan CW, Chan MW, Liu M, et al. Kinetic analysis of a unique direct prothrombinase, fgl2, and identification of a serine residue critical for the prothrombinase activity[J]. J Immunol, 2002, 168(10): 5170-5177.

[4] Zhang XP, Zhang J, Ma ML, et al. Pathological changes at early stage of multiple organ injury in a rat model of s4vere acute pancreatitis[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2010, 9(1): 83-87.

[5] Ning Q, Sun Y, Han MF, et al. Role of fibrinogen-like protein 2 prothrombinase /fibroleukin in experimental and human allograft rejection[J]. J Immunol, 2005, 174(11): 7403-7411.

[6] Su K, Chen F, Yan WM, et al. Fibrinogen-like protein 2/fibroleukin prothrombinase contributes to tumor hypercoagulability via IL-2 and IFN-gamma[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(39): 5980-5989.

[7] Clark DA, Ding JW, Yu G, et al. Fgl2 prothrombinase expression in mouse trophoblast and decidua triggers abortion but may be countered by OX-2[J]. Mol Hum Reprod, 2001, 7(2): 185-194.

[8] Gao S, Wang M, Ye H, et al. Dual interference with novel genes mfgl2 and mTNFR1 ameliorates murine hepatitis virus type 3-induced fulminant hepatitis in BALB/cJ Mice[J]. Hum Gene Ther, 2009, 21(8): 969-977.