不同剂量N-亚硝基双-2-氧丙基诱导仓鼠胰腺癌的成模效果及对相关基因表达的影响

曹维 周国雄 张海峰 丁晓凌 潘嵘嵘 瞿利帅 张弘 徐正府

自1974年Pour等采用N-亚硝基双-2-氧丙基(N-nitrosobis-2-oxopropylamin, BOP)成功诱导黄金仓鼠胰腺癌模型以来，各国学者已构建了多种胰腺癌动物模型，它们有其各自的优劣性，在临床科研应用中有不同用途[1-4]。由于仓鼠胰腺癌发病机制中K-ras基因点突变和5′CpG异常甲基化引起的p16灭活与人胰腺癌的发病机制相似，因此采用BOP制备的仓鼠胰腺癌模型是一个理想的动物模型。但研究发现，BOP诱导仓鼠肿瘤模型因诱导剂量和时间的差异而出现不同的结果[5]。为此，本研究采用不同时间、不同剂量BOP诱导仓鼠，观察其造模效果及对相关基因GAL-1、GAL-3、COX-2、5-LOX、MHC表达的影响。

材料与方法

一、实验动物和材料

叙利亚黄金仓鼠，6～8周龄，雌性，体质量80 g左右，由南通大学实验动物中心提供。人胰腺癌细胞株PANC1购自中国科学院上海生命科学研究院。BOP购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，Trazol购自invitrogen公司，实时PCR试剂盒购自fermentas公司，抗COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗体均购自美国Santa Cruz公司。

二、仓鼠胰腺癌模型的构建

取72只仓鼠，按完全随机法分为A、B、C 组，每组24只。A组采用小剂量、长周期BOP造模，即皮下注射BOP 10 mg/kg体质量，每周1次，连续8周，36周成模后处死；B组采用大剂量、短周期BOP造模，即首次皮下注射BOP 70 mg/kg体质量，1周后皮下注射BOP 20 mg/kg体质量,每周1次，连续3周，20周成模后处死；C组为未注射BOP的对照组，饲养36周处死。取胰腺组织及肝脏组织行病理组织学检查。

三、COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ mRNA表达检测

采用实时PCR方法检测mRNA的表达。根据GeneBank数据库各基因全长cDNA序列，采用Primer 5.0软件设计引物，再经过Blast进行同源性检索后，由上海invitrogen公司合成引物，以β-actin为内参。引物序列见表1。取新鲜胰腺癌组织，应用Trazol提取总RNA。先逆转录成cDNA,再行PCR扩增。实时PCR反应条件：95℃ 3 min，95℃ 40 s、54℃ 40 s、72℃ 40 s，40个循环。由仪器自带软件获取Ct值，通过公式2-ΔΔCt计算mRNA表达量，以对照组的mRNA表达量为1计算表达的倍数。

表1 COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHCⅠ、MHCⅡ以及β-actin的引物序列

四、5-LOX、COX-2、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表达的检测

采用蛋白质印迹法检测蛋白表达量。取新鲜胰腺癌组织制备组织匀浆，蛋白定量后取50 μg蛋白常规行蛋白质印迹法，以β-actin为内参。最后ECL发光，X片曝光、显影。采用美国Biorad公司Quantity One 4.0图像分析软件进行扫描分析，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

另外，采用免疫组织荧光法检测5-LOX、COX-2、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表达。新鲜胰腺癌组织行冷冻切片，4℃丙酮固定10 min，PBS洗涤后用3%过氧化氢孵育5～10 min，PBS再次洗涤后用5%～10%正常山羊血清室温封闭10 min，倾去血清，滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育1～2 h或4℃过夜,PBS冲洗后滴加适当比例稀释的TRITC标记二抗37℃孵育10～30 min，荧光显微镜下观察。

五、统计学处理

结 果

一、仓鼠造模效果

A组24只仓鼠中19只肉眼发现胰腺头部有暗红色硬结节样瘤体形成，质地坚硬，部分表面凹凸不平，可见营养血管。光镜下见胰腺癌细胞呈实性团块或巢状、条索状排列，间隔以少量间质，可见肿瘤血管；细胞明显异型，核大深染，核分裂象多见，可见明显核仁，部分可见变性坏死现象(图1)。诱导胰腺癌的成功率达79.2%。其他脏器未见异常。

图1 对照组(a)、A组(b)仓鼠胰腺组织病理改变 (HE ×400)

B组24只仓鼠胰腺均未见异常，但18只仓鼠见肝脏表面有大小不等，高低不平的灰色结节，色泽灰暗，质地坚韧。光镜下见肝内胆管癌细胞呈实性团块或巢状、条索状排列，间隔以少量间质，可见肿瘤血管；细胞明显异型，核大深染，核分裂象多见，可见明显核仁，部分可见变性坏死现象(图2)。诱导肝内胆管癌的成功率达75.0%。其他脏器未见异常。

图2 对照组(a)、B组(b)仓鼠肝组织病理改变 (HE ×400)

二、仓鼠胰腺癌组织中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的mRNA表达

A组仓鼠胰腺组织COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ mRNA的表达量分别为8.78±0.25、8.51±0.20、25.28±0.61、13.10±0.68、12.40±0.46和5.08±0.20，对照组胰腺组织分别为17.45±0.81、16.74±0.26、39.73±0.51、76.53±0.97、43.88±0.31和4.50±0.46，A组的表达量分别是对照组的1.93、2.03、1.57、5.55、3.54和0.92倍，除MHC-ⅡmRNA外，其余5个基因的mRNA表达量与对照组的差异均具有统计学意义(t值分别为9.53、27.31、19.30、23.64、25.66，P值均<0.05)。

三、仓鼠胰腺癌组织中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表达

A组仓鼠胰腺癌组织COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表达量分别为2.47±0.22、0.56±0.05、1.23±0.05、1.55±0.13、2.02±0.01和0.19±0.01，对照组仓鼠正常胰腺组织的表达量分别为0.80±0.08、0.39±0.01、0.60±0.01、0.53±0.03、0.40±0.02和0.20±0.01，胰腺癌组织COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ蛋白的表达较正常胰腺组织显著增强(图3)，差异有统计学意义(t值分别为 19.44、4.85、16.53、12.13、39.68，P值均<0.05)。胰腺癌组织MHC-Ⅱ蛋白表达与正常胰腺组织的表达差异无统计学意义。免疫组织荧光测定的结果与蛋白质印迹法的结果一致(图4)。

图3 对照组、A组仓鼠胰腺组织的蛋白表达

讨 论

亚硝基复合物是对啮齿类动物最有效的致癌剂，诱导胰腺癌的成功率高，为研究胰腺癌的发生发展过程，评估药物及其他治疗对胰腺癌的预防及疗效提供了理想的模型。但缺点是造模周期长，且亚硝基复合物缺乏对胰腺的特异性，在诱导胰腺癌的同时容易造成其他脏器的肿瘤。

有关BOP诱导造模的实验方法大致可分为小剂量长周期仓鼠皮下注射以及大剂量短周期仓鼠皮下注射两种。吴泽珊等[5]报道，BOP小剂量长周期皮下注射能成功诱导仓鼠胰腺癌模型，且成功率较高，但BOP大剂量短周期皮下注射未能诱导胰腺癌，却诱导出肝内胆管癌。本研究采用上述两种方法造模，结果同文献报道一致。仓鼠皮下注射BOP能诱导出不同的肿瘤模型，其具体机制有待进一步研究。

近年来的文献报道，GAL-1和GAL-3在多种肿瘤细胞中过表达，如肝癌、胃癌、甲状腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌，胰腺癌等，其在肿瘤的发生和发展过程中所起的作用正日益受到关注[6-10]。本课题组前期实验[11]结果显示，胰腺癌细胞株SW1990、PANC1和AsPC-1均有GAL-1、GAL-3 mRNA和蛋白的表达。胰腺癌组织亦均有GAL-1、GAL-3基因的表达，且GAL-1在胰腺癌组织中的表达和胰腺癌的分化程度相关，在胰腺癌的侵袭转移中起重要作用[11]。而正常胰腺组织无GAL-1、GAL-3基因的表达。本研究结果显示，仓鼠胰腺癌组织的GAL-1、GAL-3 mRNA和蛋白表达增强。因此，仓鼠胰腺癌模型的建立为今后研究GAL-1和GAL-3在人胰腺癌发生、发展过程中的作用机制提供了实验基础。

图4 对照组(左)和胰腺癌组(右)胰腺组织COX-2(a)、5-LOX(b)、GAL-1(c)、GAL-3(d)、MHC-Ⅰ(e)、MHC-Ⅱ(f)的表达(免疫荧光 ×400)

近年来大量研究证实，脂氧合酶和环氧合酶中的5-LOX和COX-2除了在炎症中发挥重要作用外，还参与肿瘤的发生、发展和转移，因此，5-LOX和COX-2在肿瘤的发生、发展过程中所起的作用正日益受到关注[12-15]。研究表明,5-LOX在多种胰腺癌细胞株中均有表达，而在正常人胰腺细胞中无表达，抑制5-LOX的表达可能有助于胰腺癌的治疗[16-17]。本研究结果显示，仓鼠胰腺癌组织COX-2、5-LOX的表达增强，提示仓鼠胰腺癌的发生发展与花生四烯酸的代谢也有着密切关系。因此构建仓鼠胰腺癌模型对进一步研究通过抑制两条代谢途径靶向治疗胰腺癌提供了很好的动物实验基础。

本研究前期结果显示，胰腺癌细胞株PANC1低表达MHC-Ⅱ类分子以及共刺激分子是免疫逃逸的重要机制之一。CIITA因子表达阴性是胰腺癌细胞株PANC1不能表达MHC-Ⅱ类分子基因的关键原因。采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂和甲基化转移酶抑制剂表观遗传处理后，CIITA基因Ⅳ型启动子区CpG位点甲基化程度降低，CIITA蛋白重新表达，上调MHC-Ⅰ类、Ⅱ类分子和免疫共刺激因子CD40、CD80的表达。本研究结果显示，仓鼠胰腺癌组织MHC-Ⅰ表达增强，而MHC-Ⅱ表达无明显变化，提示仓鼠胰腺癌与人胰腺癌类似，同样存在免疫逃逸现象，对研究其抗胰腺癌的免疫治疗有较好的临床应用价值。

参 考 文 献

[1] Shafer-Weaver K, Anderson M, Malyguine A, et al.T cell tolerance to tumors and cancer immunotherapy[J].Adv Exp Med Biol, 2007, 601:357-368.

[2] Poch B, Lotspeich E, Ramadani M, et al. Systemic immune dysfunction in pancreatic cancer patients[J]. Langenbecks Arch Surg, 2007, 392(3): 353-358.

[3] Dannull J，Su Z，Rizzieri D，et al．Enhancement of vaccine-mediated antitumor immunity in cancer patients after depletion of regulatory T cells[J].J Clin Invest,2005，115(12)：3623-3633.

[4] Qin H，Zhou C，Wang D，et al．Specific antitumor immune response induced by a novel DNA vaccine composed of multilple CTL and T helper cell epitopes of prostate cancer associated antigens[J]．Immunol Lett，2005, 99(1)：85-93.

[5] 吴泽珊，蒲宇，沈成义，等.大剂量BOP[N-亚硝基双(2-氧丙基)胺]诱导了金黄地鼠肝内胆管癌而非胰腺癌[J].川北医学院学报,2011,26(2)：115-118.

[6] Stockinger B，Bourgenois C，Kassiotis G．CD4+memory T cells：functional differentiation and homeostasis[J]．Immunol Rev，2006，211：39-48.

[7] Onoe K，Yanagawa Y，Minam K，et al．Thl or Th2 balance regulated by interation between dendritic cells and NKT cells[J]．Immunol Res，2007，38(1-3)：319-332.

[8] Mosmann TR, Coffman RL. Th1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties[J].Annu Rev Immunol, 1989, 7:145-173.

[9] Yamamura M,Modlin RL,Ohmen JD,et al. Local expression of anti-inflammatory cytokines in cancer[J]．J Clin Invest,1993,91(3)：1005-1010.

[10] Kharkevitch DD，Seito D,Balch GC，et al．Characterization of autologous tumor-specific T-helper 2 cells in tumor-infiltrating lymphocytes from a patient with metastatic melanoma[J]．Int J Cancer,1994,58(3)：317-323.

[11] 周国雄，张淼，丁晓凌，等.半乳凝素3在胰腺癌细胞中的表达及对胰腺癌SW1990细胞增殖和侵袭的影响[J].中华胰腺病杂志，2012,12(5)：320-322.

[12] Bellone G, Smirne C, Mauri FA, et al. Cytokine expression profile in human pancreatic carcinoma cells and in surgical pecimens: implications for survival[J]. Cancer Immunol Immunother, 2006, 55(6): 684-698.

[13] Shevach E, Davidson T, Huter E, et al. Role of TGF-beta in the induction of Foxp3 expression and T regulatory cell function[J]. J Clin Immunol, 2008, 28(6): 640-646.

[14] Terabe M, Matsui S, Park JM, et al. Transforming growth factor-beta production and myeloid cells are an effector mechanism through which CD1d-restricted T cells block cytotoxic Tlymphocyte-mediated tumor immunosurveillance: abrogation prevents tumor recurrence[J]. J Exp Med, 2003, 198(11): 1741-1752.

[15] Cao W, Zhou GX, Qiu J, et al. Research on the epigenetic modification of pancreatic cancer vaccine[J]. Hepatogastroen-terology, 2014, 61(130):272-277.

[16] Wenger FA, Jacobi CA, Kilian M, et al. The impact of laparoscopic biopsy of pancreatic lymph nodes with helium and carbon dioxide on port site and liver metastasis in BOP-induced pancreatic cancer in hamster[J]. Clin Exp Metastasis, 2000,18(1):11-14.

[17] van Kouwen MC, Laverman P, van Krieken JH, et al. FDG-PET in the detection of early pancreatic cancer in a BOP hamster model[J]. Nucl Med Biol, 2005,32(5):445-450.