紫外可见分光光度法测定藏药藏边大黄中游离蒽醌和结合蒽醌含量△

顿珠次仁 多 吉 严志宏 刘 青 达 瓦 罗 珍

(西藏藏医学院实验标本中心，西藏 拉萨 850000)

藏边大黄系蓼科大黄属波叶组植物Rheum emodi Wall的根与根茎，主要分布在西藏、青海、四川及云南等省，多为野生，西藏部分地区有种植。其根及根茎的藏名叫曲扎，藏医、蒙医用于治疗胃肠炎、肾炎，外用止血、治疮、消炎、愈伤口等;大黄供应紧张时，也曾调往各省区作大黄使用。《藏药志》载:藏边大黄，味酸，苦，性寒，能排出毒家、腑热和培根病。藏边大黄含有丰富的蒽醌类化合物，如大黄素、大黄素甲醚和大黄酚等［1］，其具有明显的抗菌消炎、免疫调节、抗衰老以及抗肿瘤等作用［2］。蒽醌类化合物在藏边大黄药材中以结合态和游离态两种形式存在。本文采用紫外分光光度法，以醋酸镁的甲醇溶液为显色剂，通过比色测定藏边大黄中蒽醌类成分的含量［3-4］，为进一步开发藏边大黄资源提供参考，也可为制订其质量指标提供方法依据。

1 仪器及试药

UV-2100紫外可见分光光度计(郑州南北仪器设备有限公司);CPA224S电子分析天平(赛多利斯);醋酸镁(Mg(Ac)2)、乙醇、乙醚、三氯甲烷、甲醇为分析纯(廊坊鹏彩精细化工有限公司)，大黄素标准品购自中国生物制品检定所;藏边大黄于2013年7月采于西藏拉萨市堆龙德庆县楚布河上游山坡(海拔4300米)，经西藏藏医学院实验标本中心多吉教授鉴定为Rheum emodi Wall。

2 样品的制备和测定方法

2.1 对照品溶液的制备:取大黄素对照品精密称量，加0.5%醋酸镁甲醇溶液定容配制成 6.132、8.063、9.988、12.036、13.993、16.077、18.12μg·mL-1的对照品溶液。

2.2 样品溶液的制备:①号供试品溶液，精密称量约0.5g样品(过60目)粉末，用索氏提取器三氯甲烷回流提取至提取液无色，浓缩提取液并转移至50mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，备用。②号供试品溶液，精密称量约0.5g样品(过60目)粉末，用索氏提取器95%乙醇回流提取至提取液无色，浓缩提取液并转移至100mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度。准确量取10mL溶液置100mL圆底烧瓶中.加热挥去乙醇，加入30mL硫酸溶液(2.5moL·L-1)加热回流1.5h，待冷却后加三氯甲烷20mL，加热回流2h，待冷却后置分液漏斗中，用三氯甲烷清洗圆底烧瓶，并入分液漏斗，分离油层和水层，水层继续用少量三氯甲烷洗涤4次并人油层，然后用少量蒸馏水洗涤数次至水层为中性为止，油层置50mL容量瓶中，加三氯甲烷稀释置刻度，摇匀，备用。

2.3 测定方法:从①号和②号供试品溶液中分别量取等量的2mL至10mL容量瓶中，自然挥去三氯甲烷，各加入0.5%Mg(Ac)2甲醇溶液并稀释至刻度，用紫外可见分光光度计以甲醇为空白，在最大吸收波长处分别测定吸光度A1和 A2(0.5%Mg(Ac)2，)，依标准曲线计算 C1和 C2。(C1为游离蒽醌含量，C2为总蒽醌含量，结合蒽醌含量=总蒽醌含量一游离蒽醌含量)

2.4 最大吸收波长选择:取对照品大黄素标准溶液(9.988μg·mL-1)，在200～800nm波长范围内测定其吸光度，可知溶液的最大吸收波长为512nm，与文献报道相吻合。

2.5 线性关系考察:取对照品溶液适量，加0.5%Mg(Ac)2 制成浓度分别为 6.132、8.063、9.988、12.036、13.993、16.077、18.12μg·mL-1的对照品溶液。以 0.5%Mg(Ac)2为空白，测定各溶液在512nm波长处的吸光度A，并以浓度C(μg·mL-1)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为:Y=35.8X+0.0272(r=0.9994)。结果表明，大黄素的醋酸镁络合物在 6.2-18.1μg·mL-1范围内有良好的线性关系，标准曲线见图1。

图1 对照品标准曲线

2.6 精密度试验:取大黄素加醋酸镁甲醇对照品溶液(16.077μg·mL-1)，在 512nm 波长处测定吸光度，RSD=0.21%(n=5)。结果证明此方法精密度很好。

2.7 稳定性试验:取大黄素加醋酸镁甲醇对照品溶液(16.077μg·mL-1)，分别于 0、2、4、6、8、10、12、14h 测定512nm吸光度，RSD=0.34010，证明此方法稳定性较好。

2.8 重复性试验:取藏边大黄药材的样品12份(每份约0.5g)，按“2.2”方法制备并测定供试品溶液。结果，游离蒽醌平均含量为0.652%(RSD=1.52%，n=6)，总蒽醌平均含量为 5.38%(RSD=2.83%，n=6)。

2.9 总蒽醌加样回收率试验:精密称取3份总蒽醌含量已知的藏边大黄药材(总蒽醌含量为5.43%)，每份约0.3g，另精密称定对照品大黄素 0.84mg、11.38mg 和 15.69mg，将此3份对照品分别加入3份样品中，按“2.2”项下②号供试品溶液制备方法制备并测定。计算加样回收率。结果显示，平均加样回收率为 99.8%(RSD=2.94%)。

3 样品测定

取藏边大黄药材粉末(过60目)4份(每份约0.5g)，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，两份测定游离蒽醌，两份测定总蒽醌，测定吸光度，根据标准曲线计算样品中蒽醌含量，结果见表1。平均结合蒽醌含量=平均总蒽醌含量一平均游离蒽醌含量=4.732%)。

表1 藏边大黄样品当中游离蒽醌和总蒽醌的测定结果表

4 讨论紫外可见分光光度法测定蒽醌含量常用两种方法，分别是碱液法和醋酸镁法，碱液法蒽醌一般在0.5h吸光度最大，th后出现缓慢衰减;醋酸镁法在1.5h内吸光度比较稳定，同时醋酸镁法较碱液法简便、稳定性高、重复性好。

［1］刘兵，杨静，王署.藏边大黄的化学成分研究［J］.华西药学杂志，2007，22(1):033-035.

［2］李军林，王志斌，李家实，藏边大黄降血糖作用的研究［J］.中药材，1997，20(5):249-250.

［3］姚桂根，孙小萍，马星航，等.用醋酸镁一甲醇比色法测定何首乌及其制剂中蒽醌类成分的含量［J］.中草药，1983，14(6):15-18.

［4］高言明，陈海云，吴小宇.醋酸镁一甲醇分光光度法测定何首乌中蒽醌类化合物的含量［J］.微量元素与健康研究，20104，(2):41-42.0