羟基酪醇对过度训练大鼠心肌线粒体动力学蛋白及自噬水平的影响

2014-07-29孙云彦殷红

山东体育学院学报 2014年3期

孙云彦+殷红

摘要：目的：研究检测ET后心肌线粒体功能，观察羟基酪醇HT对线粒体功的保护效应，并通过关注动力学及自噬蛋白变化，探讨HT保护机制。方法： 80只SD大鼠随机分成4组，即：正常对照组（CON），正常加羟基酪醇组（CON+HT），过度训练组（ET）及训练加羟基酪醇组（ET+HT）。灌胃给药，剂量为25 mg/kg/d，每周训练时间为周一至周六，共8周，氧耗法测定线粒体呼吸功能。Westerblot法检测线粒体生物合成（PGC-1α），复合物（I，II，III，IV，V），动力学（融合：Mfn1/2，OPA1；裂解：Drp1）及自噬相关蛋白（Atg5，Beclin-1及Lc3-B）。结果： ET可显著性降低线粒体呼吸控制率（RCR）及磷氧比值（P/O），下调PGC-1α及复合物I，IV，V表达，增加线粒体裂解（Drp1），降低融合（Mfn2，Opa1）。相对地，HT可有效提高线粒体P/O及复合物I，V表达水平；促进生物合成（Pgc-1α），提高融合（Mfn2，Opa1），降低裂解（Drp1）和自噬（Atg5，Lc3-B）。结论：ET造成的心肌线粒体功能异常与动力学蛋白及自噬水平变化相关。HT对上述病理性变化的抑制作用可能是其发挥保护作用的重要机制。

关键词：过度训练；心肌；生物合成；裂解；融合；自噬

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2014）03-0051-06

收稿日期：2014-01-09

基金项目：国家青年科学基金资助项目（81100174）。

作者简介：孙云彦（1982-），女，河南邓州人，在读博士，讲师，研究方向运动性疾病及康复。

作者单位：1.南阳理工学院体育教学部，河南南阳473003；2.河南大学体育学院，河南开封475000

山东体育学院学报第30卷第3期2014年6月孙云彦，等羟基酪醇对过度训练大鼠心肌线粒体动力学蛋白及自噬水平的影响No.3 2014过度训练（excessive training，ET）是一种训练与恢复、运动与运动能力、应激与应激耐受性之间的失衡状态，是指机体由于疲劳的连续积累而导致机体出现功能紊乱或病理状态[1]。现已研究证实，过度训练可损伤机体循环系统，引起心肌能量代谢酶，抗氧化蛋白表达水平降低[2-3]及心肌细胞凋亡水平增加[4]。另有研究指出，过度训练还可直接造成心肌线粒体膜通透性转换孔的开放[5]。上述病理性改变，均与线粒体损伤及功能异常直接相关。然而，有关过度训练与心肌线粒体功能异常关系的研究却鲜有报道。

羟基酪醇（Hydroxytyrosol，HT）存在于橄榄叶提取物及橄榄油，是一种多羟基酚类化合物。其分子式为C8H10O3，相对分子量为154.16。研究证实，羟基酪醇在心血管疾病[6-8]及衰老相关性退行性病变，如二型糖尿病[9]，代谢综合征[10]等的治疗中均有出色效果。推测，HT也能对过度训练造成的心肌损伤（线粒体功能紊乱）产生积极影响。另外，新近研究指出，线粒体动力学蛋白[11-12]和线粒体自噬[13]与其功能密切相关。众多与线粒体功能紊乱相关疾病的形成和发生均与动力学蛋白及自噬水平的病理性改变密切相关[11-12，14-16]。因此，线粒体融合，裂解和自噬成为近年来生命科学及医学领域内研究的新热点。

基于此，本研究建立了过度训练模型，并用HT作为干预手段，通过关注心肌线粒动力学蛋白及自噬水平的变化，探讨HT对心肌线粒体的保护作用及内在机制。

1材料和方法

1.1实验药剂

HT是由帝斯曼营养产品有限公司（Basel， Switzerland）提供的含量为15%的橄榄提取物粉末（19%总多酚）。抗体过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1 （Pgc-1） α，线粒体融合蛋白（Mfn） 1，2，裂解蛋白（Drp） 1购自于Santa公司（Santa Cruz， CA，USA）；抗体GAPDH，视神经萎缩蛋白（Opa） 1，微管相关蛋白1轻链3（Lc3B），Beclin-1及自噬蛋白（Atg） 5 购于Cell Signaling Technology （Danvers，MA，USA）。抗体线粒体复合物I，II，III，IV和 V来自于Sigma公司（Sigma，USA）。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗小鼠IgG抗体（GAPDH）及二抗购自于碧云天（Beyotime，北京）公司；甘氨酸，Tris-base （AMRESCO，USA）；NC膜，ECL发光试剂购自于密理博（MILLIPORE，USA）。

1.2研究对象

雄性Sprague dawley （SD）大鼠80只（购于郑州大学医学院动物中心），6～8周龄，体重185～215 g。以国家标准啮齿类动物饲料分笼饲养，每笼20只，自由饮食。实验大鼠饲养于温度为22℃～25℃，相对湿度为40%～60%，光照充足的动物饲养房。在正式的力竭实验开始之前，所有大鼠进行低强度训练（10 m/min， 20 min/d）进行筛选及分组。分选完成后，大鼠分4组。即：对照组（CON），安静+HT组（HT），过度训练组（ET）和过度训练+HT组（ET+HT）。

1.3运动方案

过度训练模型主要参考刘无逸等方法[17]。BW-BTM703型动物跑台（上海软隆科技）进行训练，坡度为5°，每周训练6 （周一至周六）天，休息1天。训练时间共计8周。各周训练方案具体如下：①：10 m/min，15 min；②：24 m/min，60 min；③：30 m/min，90 min；④：40 m/min，120 min；⑤～⑧：40 m/min，训练直至力竭。当体重下降幅度大于一般训练时体重的1/30及跑速和时间减为原最大值的1/3～1/6时为过度训练状态[18-19]。

1.4HT给药方案

HT采用灌胃给药，具体用量25 mg/kg体重[20]。每日1次，每周6天（周一到周六），连续8周。对照组和过度训练组不给药。

1.5透射电镜检测进行形态学观察

电镜样品制备及检测主要参考朱健等方法[21]。在最后一次力竭训练结束即刻处死大鼠，采用在体灌注法对大鼠心脏进行固定。简要如下：麻醉动物置于试验台，暴露心脏，打开右心耳，用加肝素的生理盐水刺入左心室进行1min左右灌注。之后，用灌注液（0.2 M磷酸缓冲液的配制100 ml 25%戊二醛4 ml，重蒸馏水加到200 ml）灌流心脏。待右心耳流出液为无色时，换固定液（NaH2PO4·H2O 2.6 g，Na2HPO4·12H2O29 g，重蒸馏水加至500 ml，调pH至7.4）对大鼠进行全身固定。待动物全身僵硬后，取左心室相关组织，再用4%戊二醛固定液浸透法固定材料，制备成1 mm3样品。之后送电镜中心进行镜下观察和拍照。

1.6线粒体呼抽取及呼吸功能检测

心肌组织切碎后，在4 ℃介质（0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl pH=7.4，0℃～4℃）中制备心肌组织匀浆。匀浆首先经750 g离心10 min后留上清，之后，以9 000 g离心20 min后留沉淀，重新悬浮后以9 000 g再离心20 min，弃上清得线粒体。全部操作于4 ℃进行。线粒体呼吸功能用氧耗仪（YSI，Ohio，USA）测定，方法参考Bo等方法[22]。简要如下：反应体系在一个3 ml封闭的带磁力搅拌器的玻璃槽内进行，其中包含130 mM KCl，3.0 mM HEPES，0.5 mM EDTA，2.0 mM KH2PO4，1 mg/ml BSA和2 mg线粒体蛋白，pH值为7.4，反应温度为25℃。当线粒体置于反应槽后，首先平衡3 min，之后向反应槽中加入1 mM谷氨酸盐及终浓度为0.1 mM苹果酸，以启动线粒体呼吸。在加入200 nM ADP后，线粒体进入三态呼吸。当呼吸曲线出现明显拐角时，提示呼吸过程进入四态。线粒体呼吸控制率用三态呼吸除以四态呼吸的比值表示。加入的ADP除以氧耗量，即：磷氧比值（P/O）表示线粒体能量合成水平。

1.7Western Blot 印迹检测各组大鼠心肌组织蛋白表达

选取-80℃冰箱冻存的心肌组织～120 mg，经超声粉碎，匀浆，变性，定量（BCA法）后，各取25 μg蛋白用于蛋白表达的印迹检测。简要如下：25 μg蛋白经8%～12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，通过转膜仪（DYCZ-25D，北京沃德仁和生物）将蛋白转移至NC膜。之后，蛋白与对应一抗（Pgc-1α，COX I，II，III，IV，V，Atg5，Bclin-1，兔抗大鼠单克隆抗体按照体积比为1：2000稀释；Mfn1，Mfn2，Drp1，Opa1，Lc3B单克隆抗体按照体积比为1：1000稀释）反应（4℃过夜或常温6 h）混合孵育。膜经封闭、洗脱（5 min×3）后，再和对应的二抗孵育。洗脱二抗（5 min×3），用发光液（ECL）发光，X光片曝光显像。采用图像分析软件Quantity one （Bio-Rad，California，USA）作灰度分析统计。分析过程按照以下步骤进行：首先根据条带位置创建泳道，用背景分析及区域分布进行泳道背景的排除，接下来进行条带创建，最后进行高斯建模与结果分析。

1.8统计学处理

采用PASW SPSS 20.0 （IBM，Armonk，New York，USA）分析结果，用平均值±标准差（M± SD）表示。组间比较用单因素方差分析（Student's t-test or ANOVA），P< 0.05为显著性差异，P<0.01为非常显著性差异。GraphPad Software Prism 6.01（GraphPad Software，La Jolla，California，USA）统计作图。

2结果

2.1羟基酪醇对SD大鼠心肌组织线粒体形态结构的影响

为了检测HT对心肌组织线粒体功能的影响，首先用透射电镜观察线粒体形态学的变化。图1结果显示，CON组心肌纤维排列整齐，肌丝光滑完整；线粒体轮廓清晰，内外膜结构完整。HT组线粒体形态与CON组相似，密度有所增加。ET组大鼠线粒体发生肿胀，水性变及空泡化，内膜、嵴破坏溶解改变。HT可减轻上述病理性变化，如减少膜结构损伤，维持嵴形态，减少内容物溶解及空泡化等。

形态决定功能。ET引起的线粒体形态学的改变必定会造成其功能发生变化。接下来，检测了线粒体呼吸功能的变化。如图2所示，与对照组相比，过度训练造成线粒体三态呼吸水平降低和四态呼吸水平升高，从而造成线粒呼吸比率（RCR=State3/State 4）降低，P/O水平也显著性降低（P<0.05）。虽然HT可提高线粒体三态呼吸和P/O水平（P<0.05），但对RCR并不具有显著性影响。

3讨论

本研究结果显示，过度训练可以引起心肌组织线粒体呼吸功能紊乱，其原因部分是由于ET对心肌线粒体动力学及自噬相关蛋白的病理性重塑。HT可有效维持线粒体形态结构完整及呼吸功能正常。其可能是通过抑制线粒体动力学蛋白病理性重塑及减低自噬水平而实现。下面将从HT对动力学蛋白的重塑及自噬调节两方面展开讨论。

3.1HT抑制ET对动力学蛋白的病理性重构作用

过度训练可造成心肌损伤。彭等研究指出，ET可造成心肌能量代谢酶（CK、LDH、SDH）及ATP酶的活性水平降低，同时还造成心肌组织抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）水平降低[2]。容等研究显示，ET可造成过度训练大鼠心肌细胞凋亡及炎性反应[25]。而上述病理性变化均和线粒体功能异常密切相关。本研究显示，ET可造成线粒体结构损伤和功能异常（RCR降低，P/O下降及复合物蛋白I，IV，V表达降低）（图1和图2）。相对地，HT可有效抑制或逆转这些病理性变化。

线粒体融合蛋白（Mfn）主要内膜融合蛋白及外膜融合蛋白所构成。其中，外膜融合蛋白由有Mfn1和Mfn2亚型构成，完成线粒体融合过程中的外膜融合。而Opa1主要是在内膜融合过程中发挥作用。线粒体裂解过程主要有Drp1所主导。Drp1位于细胞浆，当线粒体受损，可转位到线粒体与Fis1蛋白结合介导裂解事件的发生。适度的溶解和裂解对于维持线粒体正常功能，如结构的完整性，ETC蛋白活性，呼吸耦联，氧化磷酸化水平及能量输出等，发挥重要作用[14]。一旦上述稳态被打破，即可引起多种疾病，如心血管疾病[16]、二型糖尿病[23]等。相对地，过表达线粒体融合蛋白Mfn1/2 及Opa1，则可有效抑制心血管疾病的发生[26]。本研究显示，ET可造成线粒体融合降低及裂解增多。该结果和过度训练对骨骼肌的影响相似[20]。推测，这可能是机体的一种自我保护机制，因为线粒体片段结构的增多能够加速糖原和丙酮酸的利用，遏制氧化磷酸化功能降低。然而，上述变化虽然可能代偿性的加速线粒体在细胞内的运动速率（到达能量需要部位），但过度裂解可造成线粒体碎片结构增加（结构不完整），从而降低线粒体功能。就运动应激与线粒体形态结构的相关基因表达而言，不同的运动方式产生各异的影响效果。一次或重复进行的耐力训练可对相关基因和蛋白产生良性作用效果，如增加细胞氧耗，提高复合物蛋白活性及增加线粒体生物合成等[27]。然而，过度训练，如本研究所示，可造成线粒体生物合成水平降低，能量合成下降（图3、图4）。就调节机制而言，新近研究显示，Pgc-1α对动力学的相关基因发挥调控作用[28]。然而具体调节机制尚不明确。另外，有研究指出，ROS参与了线粒体的裂解过程[29]，ET造成的线粒体功能异常可能与其引起的氧化应激损伤相关。

与对照组相比，HT可部分提高线粒体融合及下调裂解水平。但具体调节机制尚不清楚。近年来研究证实，Pgc-1α参与了对融合和裂解的调节过程[30]。本研究证实，HT可提高Pgc-1α表达水平（图3）。这和之前相关研究结果一致[31]。关于HT对Pgc-1α的调节作用，有研究指出主要是通过提高AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）蛋白的磷酸化水平[32]而实现。另外，HT的抗氧化作用可能是其降低裂解的原因之一[31]。HT不仅能够活化AMPK，增加叉头蛋白（FOXO）3a向细胞核内的定位，上调线粒体抗氧化酶，如：过氧化氢酶（catalase），锰SOD （MnSOD）等[15]，还可促进KELCH状ECH-相关蛋白1（Keap1）与核呼吸因子（Nrf）2的解离，加速Nrf2的核定位而转录调节二相抗氧化酶的表达水平[33]。

3.2 HT降低ET引起自噬水平升高

自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。研究显示，众多疾病的发生都伴随着自噬水平的异常变化，如癌症[34]、原发性高血压[35]、衰老[24]等。就运动对自噬的影响，其主要决定于不同的运动方案。研究证实，中等强度的耐力训练可有效提高自噬水平[36-37]，并认为自噬水平的上调是运动引起保护作用的重要机制之一。然而，过度训练状态下自噬水平的变化如何，尚未见到相关报道。本研究首次证实，过度训练可造成心肌线粒体自噬水平异常升高（过度自噬，对正常线粒体形态和功能构成威胁），这可能是其造成线粒体功能异常的重要原因之一，但具体机制尚不清楚。有研究指出，过度训练可上调Foxo3a表达水平，提高自噬水平[20]。另有研究显示，氧化应激信号通路的激活是造成过度自噬发生的重要机制[34， 38]。提示，过度训练引起的氧化应激损伤可能是造成自噬水平异常的潜在机制。HT被证实能够对各种病例状态下自噬水平产生积极影响[20， 39-40]。本研究也证实，HT可有效降低ET引起的线粒体过度自噬（图5）。提示，HT对自噬的调节具有双向性。虽然HT可通过c-Jun氨基末端激酶（JNK） -p62信号通路增加二相抗氧化酶[41]，但有研究指出HT可失活细胞外信号调节激酶（ERK）1/2-JNK通路抑制自噬[34]。所以，HT介导的抗氧化作用对自噬的影响机制仍需进一步研究。

4结论

ET可造成心肌组织线粒体损伤及呼吸功能异常，该病理性变化与动力学蛋白异常重塑及自噬水平提高相关。HT可有效维持线粒体结构完整及功能正常，其作用机制可能是通过，至少部分通过维持动力学蛋白正常表达及降低自噬。提示，HT可作为预防和治疗ET引起的心肌线粒体功能紊乱的有效方法。

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