解淀粉芽孢杆菌对山茶灰斑病菌的抑制作用1)

张 静 冉晓潇 朱天辉 彭 艳 刘 洋

(四川农业大学，雅安，625014)

解淀粉芽孢杆菌对山茶灰斑病菌的抑制作用1)

张 静 冉晓潇 朱天辉 彭 艳 刘 洋

(四川农业大学，雅安，625014)

解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)及其分泌物对山茶灰斑病病原菌茶褐斑拟盘多毛孢(Pestalotiopsisguepini(Desm.) Stey)具有较好的拮抗作用。采用正交试验法探究了碳源、氮源、pH值、温度、接种量等因子对解淀粉芽孢杆菌产拮抗物质的影响。结果表明：最佳碳、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨。最佳优化条件为25 ℃、蛋白胨0.3 g、葡萄糖0.5 g、pH值6.0、每125 mL接种2 mL孢子悬液于300 mL锥形瓶中震荡培养。基于生长曲线的测定，通过研究解淀粉芽孢杆菌培养时间与代谢产物拮抗活性的关系，得到解淀粉芽孢杆菌对茶褐斑拟盘多毛孢的最佳作用时间为72 h，抑菌值达0.85。

解淀粉芽孢杆菌；茶褐斑拟盘多毛孢；正交试验；抑菌活性

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-122～125

Bacillusamyloliquefaciensand its antagonistic substance can effectively antagonizePestalotiopsisguepini(Desm.) Stey. By orthogonal design method, we studyied the effects of varied factors on antagonistic substance producing ofB.amyloliquefaciens, including carbon source, nitrogen source, cultural pH, temperature, medium oxygen and inoculated volume. The optimal carbon source and nitrogen source were glucose and peptone, and the optimal fermentation conditions were with 28 ℃, pH of 7, peptone of 0.3 g, and 125 mL medium volume in 300 mL triangle flask bulk with 2 mL inoculating volume. By studying the growth curve and the relationship between culture time and antagonistic activities, we got the bactriostatic effect ofB.amyloliquefaciensonP.guepini, and when the optimal reaction time was 72 h, the inhibiting rate was up to 85%.

KeywordsBacillusamyloliquefaciens; Fermentation condition; Orthogonal trial; Antifungal activity

山茶(Camelliajaponica)生长发育过程中易受多种病原菌侵染[1-2]，其中由茶褐斑拟盘多毛孢(Pestalotiopsisguepini(Desm.) Stey)侵染所致山茶灰斑病发生十分普遍，极大危害山茶的观赏价值，造成严重的经济损失[3-4]。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是从山茶组织内分离得到的一种内生拮抗细菌，对该病原菌具有明显的抑制作用。但目前对山茶灰斑病的研究仅限于病原菌生物学特性[5]及化学防治[6]方面，对利用寄主内生拮抗细菌防治山茶灰斑病方面的研究未见报道。芽孢杆菌属是一类能够产生抗逆性内生孢子、低分子抗生素[7]以及抗菌蛋白多肽类活性物质[8]的杆状细菌，对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用[9-12]，因而被广泛应用于生防制剂的研究[13]。目前，对于芽孢杆菌属的生防研究主要集中在枯草芽孢杆菌[14-15]、蜡状芽孢杆菌[16]、多粘芽孢杆菌[17]等，对解淀粉芽孢杆菌高产抗菌物质和生防特性方面的研究还不够完善。就此，本研究以解淀粉芽孢杆菌为研究对象，对其培养基最佳碳、氮源和发酵条件进行优化筛选，对其抗病机制和抑菌成效进行研究，旨在为该菌抑菌活性物质的鉴定、生防制剂开发，及山茶灰斑病的生物防治提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌BA10菌株，病原菌为茶褐斑拟盘多毛孢菌，均由四川农业大学森林保护实验室提供。供试培养基为PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2 样品制备

①拮抗菌发酵液：接种解淀粉芽孢杆菌于斜面培养基上，培养48 h后用无菌水洗下，25 ℃，140 r/min，旋转培养72 h，待用。②无菌滤液：取发酵液，10 000 r/min，4 ℃，离心10 min，弃沉淀，得上清液，后用0.22 μL细菌过滤器过滤得到病原菌无菌滤液。③病原菌菌饼：将活化的茶褐斑拟盘多毛孢菌接种到PDA培养基上，25 ℃恒温培养，2～3 d后用打孔器打孔(直径为5 mm)得菌饼，待用。

1.3 抗菌活性的测定

取2 mL无菌滤液于培养皿中，另取融化且冷却45 ℃左右的PDA培养基20 mL倒入其中，充分混匀后静置，待培养基冷却后，接入菌饼，平放于恒温培养箱中，28 ℃培养，用十字交叉法分别测定第4天，第5天菌落直径，不加培养液为对照，每处理重复3次，取平均值，计算抑菌值。抑菌值=相对菌落直径/对照菌落直径。

1.4 解淀粉芽孢杆菌培养条件的筛选

在基础培养基上，碳源分别选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖(用量0.5%)；氮源分别选用(NH4)2SO4、NH4NO3、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏(用量0.1%)。室温下，300 mL三角瓶装150 mL培养基，分别接种2 mL解淀粉芽孢杆菌种子液，140 r/min震荡培养72 h，设计2因素5水平正交试验L20(52)进行优化，每处理重复3次，确定培养基最佳碳、氮源。

1.5 培养条件优化

根据优化后的碳、氮源培养基，采用正交表L25(56)(表1)设计6因素5水平的正交试验进行摇瓶试验，选择最优培养条件，每个处理设置3次重复，以B.amyloliquefaciens对P.guepini的抑菌值为结果检验指标[18]。参照1.3进行抑菌活性检测。

表1 解淀粉芽孢杆菌发酵条件的试验因子及水平

注：培养条件140 r/min，72 h。

1.6 解淀粉芽孢杆菌生长量与代谢产物抑菌作用的关系

生长曲线的测定：以最优方案摇床培养解淀粉芽孢杆菌63瓶，3组重复，每组21瓶，接种开始计时，每隔6 h取一瓶，在波长650 nm处测各无菌发酵液OD值，接菌初始时OD 值为对照，直至测完21瓶，最后以发酵时间为横轴，以3组无菌发酵液OD650平均值为纵轴作生长曲线。

抑菌活性曲线的制作：离心取上层清液，旋转蒸发浓缩至原来的1/2，后用细菌过滤器抽滤制成无菌代谢产物，取2 mL制成含药平板，接种菌饼后测定解淀粉芽孢杆菌对茶褐斑拟盘多毛孢的抑菌作用，接菌初始时OD值为对照，直至测完21瓶，最后以发酵时间为横轴，以3组无菌发酵液的抑菌均值为纵轴作抑菌活性曲线，与生长曲线对比。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌产拮抗物质的最佳碳、氮源

由表2可知，不同的碳、氮源组合对解淀粉芽孢杆菌抑菌效果的影响呈显著性差异。接种菌饼后第2天，P.guepini呈不同趋势生长，部分菌生长幅度与对照等同，但菌丝明显萎缩变形；部分菌只长到培养皿1/2半径处便停止生长，且菌丝肉眼辨别不明显；更有部分菌饼处逐渐变黑，几乎无菌落增长。方差分析(表2)可知，解淀粉芽孢杆菌在葡萄糖和蛋白胨处理时无菌滤液对P.guepini的拮抗效果最好，抑菌值达到0.81，而乳糖和NH4NO3处理时无菌滤液的拮抗效果最差，为0.13。由此得出，解淀粉芽孢杆菌产拮抗物质的最佳碳、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨。

表2 解淀粉芽孢杆菌碳、氮源筛选试验结果及显著性

注：同列数据后标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。

2.2 解淀粉芽孢杆菌产拮抗物质的最佳发酵条件

以筛选出的最优培养基组分为基础，在25组解淀粉芽孢杆菌培养基发酵条件下的抑菌值分别为：0.596±0.053、0.860±0.031、0.484±0.077、0.518±0.039、0.563±0.046、0.658±0.004、0.651±0.021、0.567±0.043、0.834±0.022、0.645±0.008、0.559±0.066、0.574±0.036、0.586±0.021、0.429±0.047、0.464±0.042、0.676±0.065、0.156±0.016、0.446±0.085、0.184±0.035、0.193±0.026、0.154±0.019、0.207±0.087、0.229±0.090、0.164±0.062、0.160±0.06。极差分析结果见表3。在L25(56)正交试验中，每个因子均作5个区组处理，温度T2区组(25 ℃)的抑菌总值最大(10.068)，T5区组(40 ℃)抑菌总值最小(2.746)，因此，判断25 ℃为解淀粉芽孢杆菌拮抗效果的最适温度；同理，pH区组T1的抑菌总值显著高于其他区组，6.0为最佳pH值；T4区组125 mL为最佳瓶装量；T2区组2 mL为最佳接种量；而T2、T3区组的0.5 g/L和0.3 g/L为最适碳源、氮源。通过对正交试验结果的极差(表3)和方差分析(表4)可知，各因素对解淀粉芽孢杆菌的拮抗效果的影响差异极显著，在培养条件范围内，影响解淀粉芽孢杆菌产拮抗物质最主要的因素是温度，其次是接种量、碳源和pH。

根据表3综合得出，25 ℃条件下，pH值6.0，蛋白胨0.3 g，葡萄糖0.5 g，接种量2 mL，每125 mL接种2 mL孢子悬液于300 mL锥形瓶中振荡培养时解淀粉芽孢杆菌产拮抗物质的抑菌效果最好。在此发酵条件下，解淀粉芽孢杆菌无菌代谢产物对茶褐斑拟盘多毛孢的抑菌值高达0.85，菌落增长幅度明显受到抑制，菌丝肉眼无法辨认。由此得知，该条件即为解淀粉芽孢杆菌高产拮抗物质的最佳发酵条件。

表3 解淀粉芽孢杆菌培养基发酵条件极差分析结果

注：T为各指标总和。

表4 解淀粉芽孢杆菌发酵条件方差分析结果

注：** 为P<0.01；*为P<0.05；F0.05(4,70)=2.5；F0.01(4,70)=3.6。

2.3 解淀粉芽孢杆菌生长曲线及抗菌曲线

结合生长曲线及抑菌作用曲线可知，0～24 h抑制效果缓慢加强，但抑制率均低于0.10，此时菌体生长缓慢；24～72 h由于菌体生长迅速，抑菌活性也大幅度增强；72 h抑菌活性达到最高峰，解淀粉芽孢杆菌拮抗产物对P.guepini的抑制率高达0.85；72 h后由于解淀粉芽孢杆菌生长开始衰退，因此抑菌作用也急剧下降。由此得出，解淀粉芽孢杆菌对P.guepini的抑菌作用强度随接种时间的延长呈现先上升后缓慢下降规律，最佳作用时间为接种后的72 h(图1)。

3 结论与讨论

解淀粉芽孢杆菌可产生具有抗菌作用的低分子量抗生素及抗菌脂肽类活性物质[19]。但其所产生的抗菌物质易受外部环境影响，不同环境条件可诱导产生多种脂肽代谢产物[20]，因此研究培养基碳、氮源组成成分和发酵条件的选择对于提高解淀粉芽孢杆菌高效生产拮抗物质意义重大。

培养基成分优化试验表明，葡萄糖和蛋白胨是解淀粉芽孢杆菌最适宜的碳、氮源，不同碳、氮源组合对菌株生长影响显著，这与Caldeira等的结论[21]一致。而麦芽糖和蛋白胨组合对病原菌也具有明显的抑制作用，但由于麦芽糖的价格过高，与大规模工业生产及市场需求原则相悖，故不作考虑[22]。此外，解淀粉芽孢杆菌对培养温度、pH、接种量、瓶装量等因子要求较高。方差分析表明，最佳优化条件皆与其它水平呈显著性差异，优化后的培养条件显著提高了解淀粉芽孢杆菌的抑菌活性，使得茶褐斑拟盘多毛孢菌落生长受到阻碍，明显抑制了菌丝的萌发和分生孢子的产生，达到防治山茶灰斑病的效果。

图1 培养时间与代谢产物抗菌活性及生长趋势的关系

解淀粉芽孢杆菌生长曲线和抑菌活性曲线表明，解淀粉芽孢杆菌的生长趋势与其产生的抗菌物质数量具有一定的关系，即其抗菌活性高低与生长速率呈正相关，在72 h同时达到生长及抗菌活性峰值，之后随着菌体衰退、分解甚至死亡等自身条件限制而表现为菌株生产的降低，但究竟是代谢产物的作用或是其他作用还有待进一步研究。

解淀粉芽孢杆菌作为一种极具开发前景的生防菌，具有生长速度快，代谢产物产量高，抑菌活性强，培养条件易掌握，对多种病害具有明显防治效果等优点[23]。本试验所得出的结论进一步证明了解淀粉芽孢杆菌的生防潜力，也为该菌的生防开发与应用提供了重要参考价值，为山茶灰斑病的生物防治提供坚实的理论依据，但目前有关解淀粉芽孢杆菌的拮抗机理、拮抗物质(抗生素、抗菌脂肽类等)的化学结构和作用机制的研究未见报道，有待于进一步探究。

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BacillusamyloliquefaciensAntimicrobial Effect onPestalotiopsisguepini(Desm.) Stey/

Zhang Jing, Ran Xiaoxiao, Zhu Tianhui, Peng Yan, Liu Yang(Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, P. R. China)//

1) 国家科技基础条件平台项目(2005DK21207-13)。

张静，女，1990年4月生，四川农业大学林学院，硕士研究生。

朱天辉，四川农业大学林学院，教授。E-mail：zhuth1227@tom.com。

2013年10月23日。

S476.11

责任编辑：程 红。