氧化乐果和甲萘威亚致死剂量对黄褐天幕毛虫2种解毒酶活性的影响1)

2014-07-27胡春祥

东北林业大学学报 2014年7期

关键词：乐果毛虫天幕

付莉胡春祥

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

氧化乐果和甲萘威亚致死剂量对黄褐天幕毛虫2种解毒酶活性的影响1)

付莉胡春祥

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

室内条件下采用叶片药膜法分别测定氧化乐果和甲萘威对黄褐天幕毛虫(Malacosomaneustriatestacea)3龄幼虫的毒力；采用分光光度法测定2种药剂亚致死剂量对黄褐天幕毛虫的羧酸酯酶(CarE)，谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活性的影响。结果表明：氧化乐果对黄褐天幕毛虫的24、48 h的LC20分别为33.975、8.298 mg·L-1，甲萘威24、48 h的LC20分别为23.314、1.863 mg·L-1。经氧化乐果和甲萘威亚致死剂量处理后，幼虫体内的CarE在6～48 h内均被不同程度抑制，其中处理12 h活性降到最低，分别为对照的0.51、0.36倍；氧化乐果亚致死剂量对幼虫体内的GSTs表现为抑制-激活-抑制作用，在处理后24 h对该酶的激活作用最强，为同期对照的1.37倍。亚致死剂量甲萘威处理6～12 h内幼虫体内GSTs被激活，随后逐渐被抑制。

黄褐天幕毛虫；亚致死剂量；羧酸酯酶；谷胱甘肽S-转移酶

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-126～128，132

We adopted leaf-dip method to evaluate omethoate and carbaryl against the third instar ofMalacosomaneustriatestaceaand used sepectrophotometry to assess the effect of sublethal concentration of the two pesticides on activities of carboxylesterase and glutathione S-transferase. For 24 h and 48 h treatment, the LC20of omethoate were 33.975 and 8.298 mg·L-1, and the LC20of carbaryl were 23.314 and 1.863 mg·L-1, respectively. The activities of CarE in lavae were inhibited at different level within 6-48 h treatment of sublethal concentration of omethoate and carbary. Compared to CK, the activities of CarE were decreased by 51% and 36%, respectively, after 12 h treatment, which were decreased to the lowest level. By the treatment of the sublethal concentration of omethoat, the activity of GSTs was inhibited firstly, then increased and inhibited finally. After 24 h treatment with sublethal concentration of omethoate, the activity was increased by 1.37 times compared to that of CK, which was at highest level. Within 6-12 h of treatment with sublethal concentration of carbaryl, the activity of GSTs in larvae was increased firstly, and then decreased gradually.

KeywordsMalacosomaneustriatestacea; Sublethal doses; Carboxylesterase; Glutathione S-transferase

黄褐天幕毛虫(Malacosomaneustriatestacea)属鳞翅目枯叶蛾科，其分布范围广，食性杂，危害重，主要以幼虫危害柞树、柳树、杨树、桦树等阔叶树[1-2]，严重发生时，可将被害树木叶片全部吃光，造成林木上部枯死，给林木生长造成严重危害[3]。长期不合理的使用杀虫剂，会使害虫的抗药性逐渐增强，而杀虫剂的亚致死效应能够导致昆虫生理、行为的改变，生殖力的变化，发育历期的变化以及昆虫体内重要的靶标酶和解毒酶系的变化等[4-5]。研究杀虫剂对昆虫的亚致死效应，有助于正确评价化学农药的防治效果，协调化学防治与生物防治[6]。本研究主要测定了黄褐天幕毛虫经亚致死浓度(LC20)的氧化乐果、甲萘威处理后幼虫体内羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活性的变化，以期为氧化乐果、甲萘威的合理使用和黄褐天幕毛虫的综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

95.8%甲萘威原药(南开大学国家农药工程中心)；82.8%氧化乐果原油(郑州沙隆达伟新农药有限公司)；固蓝B盐、十二烷基硫酸钠(SDS)、毒扁豆碱、1-氯-2，4二硝基苯(CDNB)、考马斯亮蓝G-250、还原型谷胱甘肽(GSH)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫代苏糖醇(DTT)均购自Sigma公司，Triton X-100购自AMRESCO公司，α-乙酸萘酯(α-NA)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、丙酮、牛血清白蛋白均购自天津永大化学试剂有限公司，均为分析纯。电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、D-37520冷冻离心机(德国Sorvall,biofuge stratos)、TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、电子天平(美国奥豪斯Explorer Pro)。

1.2 供试虫源

黄褐天幕毛虫于2013年5月采自东北林业大学实验林场，幼虫用健康无药剂的新鲜杨树叶片饲养，每天换叶并及时清理幼虫的排泄物及食物残渣，选取健康、大小一致的3龄幼虫用于毒力和酶活性测定。

1.3 毒力测定

采用叶片药膜法，先将原药用丙酮配成5×104mg·L-1的母液，再用蒸馏水(含0.1% Triton X-100)将母液稀释为800、400、200、100、50、10 mg·L-1，以蒸馏水(含0.1% Triton X-100)处理作对照，将新鲜无农药污染的杨树叶片浸于稀释好的农药中10 s，在阴凉处晾干，用蘸有充足水分的脱脂棉裹住叶柄，放于透气性良好的透明养虫瓶(直径9 cm、高14 cm)中，接入健壮且饥饿12 h的黄褐天幕毛虫3龄幼虫，每瓶放10头，每个浓度重复3次，置于恒温养虫室(温度(25±1)℃，相对湿度60%～80%，光周期16 h光照8 h黑暗)饲养。分别于6、12、24、36、48 h后检查死亡数，用毛笔轻触幼虫，非功能性颤抖者视为死亡。

1.4 试虫处理

根据毒力测定结果，以24 h的LC20值作为亚致死剂量，处理健康、大小一致且饥饿12 h的黄褐天幕毛虫3龄幼虫，以清水处理为对照，处理方法和饲养条件同1.3。分别于处理6、12、24、48 h后取健壮、活泼的幼虫，冰箱中-80 ℃保存，用于酶活性的测定。

1.5 酶活性测定

羧酸酯酶活性：随机挑取3头3龄天幕毛虫放入3 mL 0.04 mol·L-1预冷的磷酸缓冲液(pH=7.0)中，冰浴，匀浆，于4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清液为待测酶液。活性测定参考Van Asperen[7]的方法，在试管中加入0.04 mol·L-1磷酸缓冲液(pH=7.0)0.45 mL，1.8 mL 3×10-4mol·L-1α-乙酸萘酯(含毒扁豆碱1∶1)，0.05 mL待测酶液，摇匀后在30 ℃水浴中精确计时15 min，加入0.9 mL显色剂(V(1%固蓝B盐)∶V(5%十二烷基硫酸钠)=2∶5)终止反应，在600 nm波长下测定OD值，每个处理重复3次。根据α-萘酚标准曲线计算出羧酸酯酶催化生成的α-萘酚量，再根据蛋白质含量，计算出羧酸酯酶的比活力。

谷胱甘肽S-转移酶活性：随机挑取3头3龄黄褐天幕毛虫放入3 mL 0.1 mol·L-1、pH=6.5预冷的磷酸缓冲液(含1 mmol·L-1EDTA-Na2，0.1 mmol·L-1PMSF，0.1 mmol·L-1DTT)，匀浆，于4 ℃，10 000 r/min离心30 min，取上清液为待测酶液。活性测定参照Habig等[8]的方法，在试管中加入2.3 mL 0.1 mol·L-1磷酸缓冲液，0.5 mL还原型谷胱甘肽和0.1 mL酶液，最后加入0.1 mL 1.0 mmol·L-1CDNB显色液并混匀，在空白对照杯中用磷酸缓冲液代替正常酶液，于340 nm波长处，用时间驱动程序在双光束紫外可见分光光度计上记录3 min内(每隔30 s读一次)动力学曲线，记录反应速度。GSTs活性以每毫克蛋白质每分钟分解底物的微摩尔数表示。

蛋白质含量测定参照Bradford[9]的考马斯亮蓝G-250法。

1.6 数据统计分析

使用POLO软件处理分析毒力测定结果，计算亚致死浓度(LC20)及95%置信区间；使用SPSS 17.0进行方差分析，采用LSD法进行差异显著性检验，显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 氧化乐果和甲萘威对黄褐天幕毛虫的毒力

表1显示了氧化乐果和甲萘威对黄褐天幕毛虫3龄幼虫的亚致死浓度(LC20)和致死中浓度(LC50)及其95%置信区间。随着处理时间增长，LC20和LC50逐渐减小，杀虫剂毒力越来越大。氧化乐果和甲萘威对黄褐天幕毛虫24 h的致死中浓度LC50分别为84.555、93.052 mg·L-1；24 h亚致死剂量LC20分别为33.975、23.314 mg·L-1。

表1 氧化乐果和甲萘威对黄褐天幕毛虫的毒力

2.2 亚致死剂量杀虫剂对黄褐天幕毛虫幼虫CarE活性的影响

氧化乐果亚致死剂量处理后，黄褐天幕毛虫体内CarE活性随处理时间的延长表现为先降后升再降的趋势。处理6 h后，体内的CarE活性略有增强，但与对照组差异不显著(P>0.05)，其余各时间点，处理组的CarE活性均低于对照，且差异极显著(P<0.01)，氧化乐果对该酶活性主要表现为抑制作用。其中，处理12 h后，对该酶的抑制作用最强，活性为对照组的0.51倍。黄褐天幕毛虫受甲萘威胁迫后，CarE活性在各个时间点，处理组CarE活性均低于对照组，差异极显著(P<0.01)，其中，12 h抑制率最大，活性为对照的0.36倍(表2)。可见，亚致死剂量的氧化乐果和甲萘威均对黄褐天幕毛虫体内的CarE具有明显的抑制作用。

表2 亚致死剂量杀虫剂对黄褐天幕毛虫幼虫解毒酶活性的影响

注：表中数据为平均值±标准误，比值=处理组酶比活力/相应对照组酶比活力，** 表示处理组与对照组之间差异显著(P<0.01)。

2.3 亚致死剂量杀虫剂对黄褐天幕毛虫幼虫GSTs活性的影响

氧化乐果和甲萘威处理后，黄褐天幕毛虫幼虫体内的GSTs活性处于动态变化中(表2)。48 h处理时间内，亚致死剂量的氧化乐果对该酶活性呈先抑制再激活再抑制的趋势，处理6 h后，处理组黄褐天幕毛虫体内GSTs为同期对照组的0.82倍，且与对照组差异极显著(P<0.01)。处理12和24 h，分别为对照组的1.20和1.37倍，表现为显著的激活作用(P<0.01)，随后在48 h GSTs活性被抑制。亚致死剂量的甲萘威对黄褐天幕毛虫体内的GSTs在6和12 h表现为激活作用，其中处理组12 h的酶活性为同期对照组的1.31倍，与对照组差异极显著(P<0.01)；而在24～48 h，对该酶活性表现为抑制作用，48 h酶活性为6 h酶活性的58.64%，是同期对照组的0.76倍，与对照组差异极显著(P<0.01)。

3 结论与讨论

羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶是昆虫体内重要的解毒酶，能够代谢有毒外源化合物，使昆虫自身减少或免除毒害作用[10]。羧酸酯酶具有广泛的底物专一性及重叠性，能催化水解脂肪族羧酸酯、芳酸酯和相应的硫代酯等多种化合物，害虫通过产生大量该酶与杀虫剂结合，使杀虫剂在到达靶标位点之前被阻断或降解[11]。张元建等[12]研究了甜菜夜蛾(Spodopteraexigua(Hübner))经亚致死剂量的辛硫磷LC20处理后，酶活性在24 h时与对照相比降低了77.58%，经溴氰菊酯亚致死剂量LC20处理后，酶活性在48 h内持续下降。廖月枝等[13]研究发现甲氧虫酰肼对舞毒蛾(LymantriadisparL.)4龄幼虫的羧酸酯酶有明显抑制作用，在各个处理时间点，对该酶的抑制作用与对照组差异极显著。本研究表明，不同药剂对黄褐天幕毛虫羧酸酯酶抑制作用不同，亚致死剂量的氧化乐果对黄褐天幕毛虫羧酸酯酶活力在12 h之后开始表现出明显的抑制作用，而亚致死剂量的甲萘威的抑制作用在6 h之后就开始明显，且两种药剂处理后的48 h内，处理组的羧酸酯酶的活性均明显低于对照组，关于这两种药剂对羧酸酯酶的具体影响机制需要进一步研究。

谷胱甘肽S-转移酶是催化还原型谷胱甘肽与各种亲电子化合物进行亲和加成反应的一种酶，参与很多分子的解毒机制，并转运一些重要的亲脂性化合物，在昆虫遭遇逆境时，发挥脱毒和抗氧化功能，是昆虫对有机磷类杀虫剂产生抗性的重要因素[14-16]。陈凤菊等[17]用含0.005%单宁酸的饲料饲养5龄和6龄棉铃虫(Helicoverpaarmigera(Hübner))幼虫后，谷胱甘肽S-转移酶活性明显降低，分别为对照的59%和67%。魏波等[18]研究了辛硫磷亚致死剂量处理棉铃虫3龄幼虫24 h后，活性达到高峰，比活力比对照组增加了53%。本研究表明，氧化乐果和甲萘威对黄褐天幕毛虫体内的谷胱甘肽S-转移酶的活性影响不仅与杀虫剂种类有关，而且具有一定的时间效应。亚致死剂量的氧化乐果对黄褐天幕毛虫谷胱甘肽S-转移酶在6 h时与同时期的对照相比表现为抑制作用，12～24 h表现为激活作用，随后在48 h酶活性又被抑制。而亚致死剂量的甲萘威处理黄褐天幕毛虫后，体内谷胱甘肽S-转移酶活性在6～12 h被激活，在48 h时活性被显著抑制，而有关两种杀虫剂对羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶作用的生物化学和分子生物学机制有待进一步研究。

[1] 刘岩,张立志,周素娟.黄褐天幕毛虫生物学特性与防治[J].辽宁林业科技,2004(5):7-9,21.

[2] 齐学军,孙德莹,关昕.无公害药剂对天幕毛虫的防治效果[J].辽宁农业科学,2007(6):40-40.

[3] 郑淑杰,王瑞玲.大兴安岭地区黄褐天幕毛虫发生规律原因及防治[J].内蒙古林业调查设计,2004,27(3):41-44.

[4] 韩文素,王丽红,孙婳婳,等.杀虫剂对昆虫的亚致死效应的研究进展[J].中国植保导刊,2011,31(11):15-20.

[5] 董利霞,谭晓伟,芮昌辉.甲氨基阿维菌素苯甲酸盐亚致死剂量对不同敏感性棉铃虫解毒酶活性的影响[J].植物保护,2011,37(5):164-168,175.

[6] 韩文素,张树发,沈福英,等.高效氯氰菊酯对小菜蛾阿维菌素抗性、敏感种群的亚致死效应[J].环境昆虫学报,2011,33(3):335-341.

[7] Van Asperen K. A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method[J]. Journal of insect physiology,1962,8(4):401-416.

[8] Habig W H, Pabst M J, Jakoby W B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation[J]. The Journal of Biological Chemistry,1974,249(22):7130-7139.

[9] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical biochemistry,1976,72(1):248-254.

[10] 张彦广,王志刚,黄大庄.桑天牛羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶与杨树次生代谢物质相关性研究[J].林业科学,2001,37(3):106-111.

[11] 王光峰,张友军,柏连阳,等.多杀菌素对甜菜夜蛾多酚氧化酶和羧酸酯酶的影响[J].农药学学报,2003,5(2):40-46.

[12] 张元建,王真,竹傲,等.溴氰菊酯和辛硫磷亚致死剂量对甜菜夜蛾酶活性的影响[J].天津农业科学,2009,15(5):37-40.

[13] 廖月枝,严善春,曹传旺,等.甲氧虫酰肼对舞毒蛾幼虫解毒酶及其体内蛋白质表达的影响[J].林业科学,2012,48(8):99-105.

[14] 吕敏,刘惠霞,吴文君.谷胱甘肽S-转移酶与昆虫抗药性的关系[J].昆虫知识,2003,40(3):204-207,228.

[15] 陈凤菊,高希武.昆虫谷胱甘肽S-转移酶的基因结构及其表达调控[J].昆虫学报,2005,48(4):600-608.

[16] 雷安平,陈欢,黎双飞,等.谷胱甘肽S-转移酶的功能、应用及克隆表达[J].环境科学与技术,2009,32(12):85-91.

[17] 陈凤菊,高希武,雷明庆,等.单宁酸对棉铃虫谷胱甘肽S-转移酶的影响[J].昆虫学报,2003,46(6):684-690.

[18] 魏波,郝赤,李会仙.杀虫剂亚致死剂量对棉铃虫靶标酶的影响[J].现代农药,2006,5(3):35-38.

Effect of Sublethal Concentration of Omethoate and Carbaryl on the Activities of Two Detoxifying Enzymes inMalacosomaneustriatestacea/

Fu Li, Hu Chunxiang(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//

1) 国家林业局公益项目(201104069)。