Livin、Caspase-9在十二指肠腺癌中的表达及临床意义

倪文凯，于东风，刘 弋

凋亡是正常机体细胞保持稳定的重要措施之一，是调节机体组织平衡的重要机制，是一个受到严密监控的过程。基因的异常改变会导致细胞凋亡受到抑制，最终导致肿瘤的发生和发展［1］。凋亡抑制蛋白Livin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成员，特异的高表达于某些实体肿瘤组织和肿瘤细胞系中［2］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)是一种促凋亡因子，是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶族中的一员，是执行细胞凋亡的主要酶类之一［3］。为了研究两者对十二指肠腺癌发生发展的影响，该研究通过免疫组化法检测十二指肠腺癌中两者的表达情况，旨在探讨二者在十二指肠腺癌发生发展过程中的相互作用，从而为十二指肠腺癌的诊断与临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集我院2006年1月～2012年12月经手术切除并经病理验证的有完整临床资料的十二指肠腺癌患者的存档组织蜡块60例作为实验组，其中男32例，女28例，年龄36～84岁，平均45.4岁。所有患者术前均未接受化疗及放疗。同时选取同组病例癌旁正常组织标本30例作为对照组。

1.2 主要试剂 兔抗人Livin多克隆抗体及兔抗人Caspase-9多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;通用型二步法检测试剂盒(PV-6000)、PBS缓冲液、枸橼酸缓冲液、DAB显色液等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法 采用免疫组化PV-6000两步法。每次染色均设立阳性及阴性对照组，(以PBS液代替一抗作为阴性对照)。结果判断:Livin以细胞质和(或)细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。Caspase-9以细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。选择合适部位选取5个高倍视野，每个高倍镜视野计数100个细胞，高倍镜下计数阳性细胞比例，以＞20%为阳性表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行分析，各组之间比较相关性检验和χ2检验，并计算Pearson列联系数r。

2 结果

2.1 Livin及Caspase-9在十二指肠腺癌及癌旁组织中的表达情况 Livin及Caspase-9在十二指肠腺癌及癌旁组织均有阳性表达，其中Livin在实验组中的阳性率明显高于对照组(P＜0.01)，Caspase-9在实验组中的阳性率明显低于对照组(P＜0.01)。见表1、图1。

2.2 Livin、Caspase-9在十二指肠腺癌中的表达与临床病理参数的关系 Livin的表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤发生部位比较差异无统计学意义，与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移比较差异有统计学意义(P＜0.05)，Caspase-9的表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤发生部位及浸润深度比较差异无统计学意义，与淋巴结转移、肿瘤的分化程度比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.3 Livin与Caspase-9在十二指肠腺癌中表达相关性分析 43例Livin蛋白阳性表达的十二指肠腺癌组织中7例Caspase-9表达阳性，17例Livin蛋白阴性的十二指肠腺癌中有8例Caspase-9表达阳性。Livin与Caspase-9的表达差异有统计学意义(P＜0.05，r=－0.320)，见表3。两者的表达呈负相关性。

表1 Livin在十二指肠腺癌及癌旁组织中的表达情况［n(%)］

图1 十二指肠腺癌及癌旁正常组织中Livin及Caspase-9的表达 SP×400

表2 Livin、Caspase-9的表达与临床病理参数之间的关系［n(%)］

表3 十二指肠腺癌中Livin与Caspase-9表达之间的关系［n(%)］

3 讨论

细胞凋亡是机体重要的生理过程，对维持内环境的稳定有着关键的作用。细胞凋亡功能的异常最终导致肿瘤的发生和发展。Livin基因位于人染色体20q13.3，全长4 600 bp，包含6个内含子和7个外显子。其编码的Livin蛋白含有IAP家族成员中特有的BIR结构和RING指结构。其中RING结构调控着Livin蛋白在细胞内的合理分布，BIR结构是Livin蛋白发挥抗凋亡作用的重要结合部位，通过与Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 以及凋亡前体蛋白SMAC等酶的结合，达到阻断凋亡受体以及以线粒体为基础的凋亡途径而起到抑制细胞凋亡的作用［4］。Yagihashi et al［5］通过酶联免疫吸附实验检测癌症患者血清中抗Livin抗体，发现肺癌、乳腺癌、肾癌、食管癌、胃癌、胆管癌和结直肠癌患者血清中抗Livin抗体高表达 。Xi et al［6］用免疫组化法发现在结直肠癌患者中Livin呈高表达，其表达水平与患者总体生存率呈负相关。本实验结果表明Livin在对照组中低表达，实验组中高表达，并与肿瘤浸润深度、淋巴结转移呈正相关，与肿瘤的分化程度呈负相关，提示Livin表达的升高可能与十二指肠腺癌的发生和发展有关系，同时Livin的表达可能影响十二指肠癌的生物学行为，使其发生转移等恶性转化行为，有可能成为癌症预后及治疗情况的判断指标之一。

Caspase-9是内源性凋亡途径中的关键蛋白酶，当细胞接收到凋亡信号后，线粒体释放Cyt C及凋亡活化因子(Apaf-1)。两者结合以后形成凋亡小体，共同激活Caspase-9，活化后的Caspase-9进一步激活下游的效应Caspase，从而参与调节过程［7］。本研究显示Caspase-9在实验组的阳性表达明显低于对照组，并且与肿瘤有无淋巴结转移呈负相关，与肿瘤的分化程度呈正相关。提示Caspase-9的异常表达参与了十二指肠腺癌的发生和发展。

Kasof et al［8］通过实验证明:Livin 能够直接抑制 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的水解作用，Livin蛋白的BIR结构能够与Caspase结合从而抑制其功能。同时Livin还能直接在凋亡的起始点干扰Procaspase-9或者直接干扰Caspase-9的活性［9］。本研究表明Livin与Caspase-9的表达呈负相关性。Livin蛋白和Caspase-9的具体作用机制以及两者之间的关系还有待进一步的研究证实。二者的联合检测可视为判断患者预后以及治疗效果的重要标志和预测因子。

［1］Rohayem J，Diestelkoeller P，Weigle B，et al.Antibody response to the tumor-associated inhibitor of apoptosis protein surviving in cancer patients［J］.Cancer Res，2000，60(7):1815 －7.

［2］Grzybowska-Izydorczyk O，Smolewski P.The role of the inhibitor of apoptosis protein(IAP)family in hematological malignancies［J］.Postepy Hig Med Dosw，2008，62(14):55 －63.

［3］Strappazzon F，Torch S，Chatellard-Causse C，et al.Alix is involved in caspase 9 activation during calcium-induced apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，397(1):64 －9.

［4］Sun J G，Liao R X，Zhang S X，et al.Role of inhibitor of apoptosis protein Livin in radiation resistance in nonsmall cell lung cancer［J］.Cancer Biother Radiopharm，2011，26(5):585 －92.

［5］Yagihashi A.Anti-survivin and anti-livin antibodies［J］.Nihon Rinsho，2010，68(Suppl 6):708 －10.

［6］Xi R C，Biao W S ，Gang Z Z.Significant elevation of survivin and livin expression in human colorectal cancer:inverse correlation between expression and overall survival［J］.Onkologie，2011，34(8-9):428－32.

［7］Bratton S B，Salvesen G S.Regulation of the Apaf-1-caspase-9 apoptosome［J］.J Cell Sci，2010，123(pt 19):3209 －14.

［8］Kasof G M，Gomes B C.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］.Biol Chem，2001，276(5):3238 －46.

［9］Vucic D，Stennicke H R，Pisabarro M T，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］.Curr Biol，2000，10(21):1359 －66.