GSTM1、GSTT1基因多态性与新疆维吾尔族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系

王妨娥，凌 敏，白 杰，苟安栓，钱建辉，赵宗峰

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的特征为不完全可逆的气流受限，气流受限通常是与肺部异常炎症反应的有害颗粒或气体有关［1］。Thakur et al［2］研究报告已经证实蛋白酶-抗蛋白酶和氧化酶-抗氧化酶的失平衡是导致COPD的主要因素。氧化酶-抗氧化酶失平衡导致的氧化应激可以损害气道上皮组织和肺间质，增强炎症反应，使促炎症细胞因子基因上调，进而影响COPD的发生和发展。谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase，GST)作为其中的抗氧化酶在肺部起着保护作用，可以催化各种与还原型谷胱甘肽共轭的电化合物。因此，COPD的发展机制中可能不仅仅包括蛋白酶-抗蛋白酶失平衡，也有氧化酶-抗氧化酶失平衡的参与。很多研究［3－6］表明，COPD与GSTs的相关性存在民族和地域的差异。由于地理位置特殊，冬季漫长，气候寒冷，COPD是新疆地区常见的呼吸系统疾病。凌敏 等［7］对新疆农村地区COPD危险因素调查后发现，维吾尔族和哈萨克族人群中COPD患病率较高。鉴于GSTM1、GSTT1基因多态性的分布在不同民族及地区间存在较大差异，且与新疆维吾尔族COPD的相关性研究未见相关报道，因此，该研究对GSTM1、GSTT1基因多态性与新疆维吾尔族COPD易感性的关系进行了研究，并与其他种族进行对比。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2011年8月～2013年8月在新疆维吾尔自治区人民医院呼吸科住院治疗的新疆维吾尔族COPD患者80例(COPD组)，均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》标准［1］，选择年龄、性别匹配的本院健康体检者80例为对照组，且肺功能符合以下指标:第一秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)＞70%，FEV1≥80%预计值，两组均排除支气管扩张、支气管哮喘、肺部肿块、结核性胸膜炎、胸廓畸形、肺间质纤维化等呼吸系统疾病及其他感染性疾病、外伤及自身免疫性疾病。两组年龄及性别均无显著差异，具有可比性。两组均为无民族间遗传干扰(与其他民族人无通婚情况)、无血缘关系的连续两代及以上长期居住于新疆的维吾尔族人群，所有受试者均签署书面的志愿书，该研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 全血基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)，GSTM1、GSTT1及白蛋白3对引物合成、Taq 酶、10 × Buffer、dNTP、ddH2O 均购于北京鼎国生物科技有限公司，DNA Marker购于BBI公司，DMSO购于美国Sigma公司，其他均为分子生物学常规试剂。

1.3 研究方法

1.3.1 标本采集 在清晨空腹时采集研究对象的静脉血2 ml，EDTA抗凝，将抗凝管上下轻轻颠倒8～10次，使血液与抗凝剂充分混合，－20℃低温保存。

1.3.2 基因组DNA提取 利用全血基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)，按照厂家提供的说明书方法提取全血基因组DNA。提取的DNA置于－20℃保存备用。

1.3.3 多重PCR法检测GSTM1和GSTT1基因多态性 依据文献合成GSTM1、GSTT1及白蛋白3对引物［6］，其中白蛋白为阳性内对照。3对引物序列如下，GSTM1上游引物:5'-GAACTCCCTGAAAAGC TAAAGC-3'，下游引物:5'-GTTGGGCTCAAATATAC GGTGG-3';GSTT1上游引物:5'-TTCCTTACTGGTCC TCACATCTC-3，下游引物:5'-TCACCGGATCATGG CCAGCA-3';白蛋白上游引物:5'-GCCCTCTGCTAA CAAGTCCTAC-3'，下游引物:5'-GCCCTAAAAAGA AAATCGCCAATC-3'。PCR 扩增反应体系(20 μl):10 × Tap Buffer 2 μl，10 mmol/L dNTP 混合物 2 μl，10 μmol/L 3 对上、下游引物各 0.5 μl，Taq 酶 5 U，50 ng/μl人基因组 DNA 1 μl，DMSO 1 μl，超纯水补足20 μl;PCR反应条件:95℃预变性5 min;接着进行扩增，包括94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环;然后72℃延伸5 min，最后4℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离后，采用凝胶成像系统观察并判别基因型。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以±s表示;年龄、吸烟指数(用年吸烟包数表示:平均每天吸烟支数×吸烟年数/20)，均数比较采用两独立样本t检验，计数资料比较采用χ2检验;各组间基因型和等位基因频率的比较以及Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度采用χ2检验;多因素调整采用Logistic回归分析，计算比值比(odds ratios，OR)和95%可信区间 (confidence intervals，CI)用来检测 GSTM1、GSTT1与 COPD的相关性。所有统计均为双侧，显著性检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 一般资料的比较 两组资料在性别(男 ∶女比例为44∶36和41∶39)和年龄(平均年龄54.4±15.2和54.5±12.0)方面差异无统计学意义，两组间吸烟指数差异均无统计学意义，两组间FEV1预计值及FEV1/FVC差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 GSTM1、GSTT1基因纯合缺失的检测结果

所有样本均能在350 bp处扩增出阳性内对照白蛋白目的条带，480 bp处出现一条带为GSTM1纯合缺失型;215 bp处出现一条带即为GSTT1纯合缺失型;只出现一条白蛋白对照条带为GSTM1、GSTT1同时为纯合缺失型;在480 bp和215 bp出现两条带为GSTM1、GSTT1非纯合缺失型，见图1。

图1 GSTM1、GSTT1基因多重PCR分析结果

2.3 GSTM1、GSTT1基因型在COPD组和对照组之间的分布差异 如表1所示新疆维吾尔族COPD组GSTM1纯合缺失型基因型频率(70.0%)高于对照组的频率(51.3%)(P=0.015);GSTT1基因纯合缺失型频率在COPD组(40.0%)与对照组(21.3%)比较差异有统计学意义(P=0.01);GSTM1、GSTT1基因纯合缺失型的基因频率在COPD组与对照组的差异有统计学意义 (P=0.002)。以研究对象是否患COPD为因变量经Logistic回归分析(协变量包括年龄、性别、吸烟史、GSTM1及GSTT1基因型)，经调整年龄、性别和吸烟史后，发现GSTM1基因纯合缺失型则为COPD的危险因素 (OR=2.22，95%CI:1.16 ～4.25，P=0.016);GSTT1基因纯合缺失型为COPD的危险因素(OR=2.47，95%CI:1.23 ～ 4.97，P=0.011)，GSTM1、GSTT1同时为纯合缺失型则为COPD的危险因素(OR=4.67，95%CI:1.65～13.14，P=0.004)。

表1 GSTM1、GSTT1基因型在COPD组和对照组之间的分布差异［n=80，n(%)］

2.4 比较不同种族COPD组和对照组GSTM1、GSTT1基因型分布 由表2可见，GSTM1纯合缺失型在哈萨克族、维吾尔族、北印度人和突尼斯人群中COPD组及对照组之间差异有统计学意义(P＜0.05);GSTT1纯合缺失型、GSTM1、GSTT1同时纯合缺失型在维吾尔族人群中差异有统计学意义(P＜0.05);而汉族人群中3种基因型在COPD组和对照组中差异均无统计学意义。

表2 两组GSTM1、GSTT1基因型分布［n(%)］

3 讨论

COPD 是多基因参与的复杂疾病，多个基因的多态性在COPD的易感性方面可能相互作用。氧化－抗氧化失衡是机体患COPD的一个主要发病机制，而抗氧化酶在其中起着重要作用。GSTs是一个超家族的酶系，参与许多亲电子致癌物的解毒过程，在很多外源性化合物和药物的解毒过程起着重要的作用［1］，从而起着保护肺组织的作用。

本研究首次分析了新疆维吾尔族人群GSTM1、GSTT1与 COPD易感性的关系。提示 GSTM1、GSTT1基因与新疆维吾尔族人群的COPD有显著的相关性。对照组与COPD组对比结果提示GSTM1纯合缺失型、GSTT1纯合缺失型、GSTM1、GSTT1同时为纯合缺失型时是COPD的危险因素，在除去COPD的主要危险因素后，两组间的差异仍有统计学意义。因此，GSTM1纯合缺失型、GSTT1纯合缺失型是COPD的独立危险因素。

本研究结果提示GSTM1纯合缺失型、GSTT1纯合缺失型可能和COPD易感性相关。Shuk et al［4］在北印度人群中研究表明:GSTM1纯合缺失型基因为COPD的独立危险因素。马志明 等［8］对中国汉族人群研究发现GSTM1纯合缺失基因型可能增加了长期大量吸烟人群对COPD的易感性，若同时伴有GSTT1的纯合缺失型基因可进一步增加对COPD的易感性。Smolonska et al［9］在亚洲人群中采用 Meta分析时发现GSTM1基因纯合缺失型为COPD的独立危险因素，但进行分层分析后发现GSTM1基因纯合缺失型可能不是COPD的独立危险因素。此前，杨瑞红 等［10］研究报道，GSTM1、GSTT1基因多态性与汉族人群COPD易感性没有相关性，未发现两个基因之间有明显的协同作用。Lakhdar et al［5］没有发现GSTM1基因多态性和突尼西亚人群COPD有独立相关性。本课题组的前期研究［6］中也没有发现GSTM1基因多态性与新疆哈萨克族人群的COPD有独立相关性。这说明GSTM1、GSTT1基因在不同人群中的作用机制或对COPD的影响不同，可能与种族、地域等差异有关。这些研究结果提示，各地区各民族之间GSTM1、GSTT1基因分布确实存在差异。这可能是一些相关疾病在不同种族、不同区域间具有的不同发病率和临床特点的主要原因。

有研究［10］显示，携带GSTT1基因纯合缺失型的人群比携带GSTT1非纯合缺失型可能更容易导致具有遗传毒性和肺部疾病，这可能与GSTT1在肺部没有表达有关。近年来研究［11－13］证明COPD发生、发展过程中存在全身炎症反应和全身性氧化应激反应。GSTT1可能通过参与拮抗全身性氧化应激的过程，起到一定的抗氧化作用。有研究［14］报道GSTM1基因纯合缺失型及其他参与抗氧化过程基因的变异(例如GSTP1和环氧化物水解酶)是COPD的危险因素。因此，在今后的研究中，需扩大样本量及增加其它参与氧化－抗氧化酶的研究(例如GSTP1或环氧化物水解酶等)，以寻找出效度较高的COPD易感性遗传标记，以期为COPD防治提供新思路、新策略。

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