黄酒中蛋白质沉淀的研究进展

2014-07-26詹汉林肖招燕韩珍郭庆东

食品研究与开发 2014年12期

詹汉林，肖招燕，韩珍，郭庆东

（广东长乐烧酒业股份有限公司，广东梅州 514469）

黄酒浑浊的类型，一般分为生物浑浊和非生物浑浊这两种。生物浑浊产生的原因是微生物污染，对原料彻底灭菌，同时管理生产过程防止杂菌污染，这样就可以避免；而非生物浑浊是由蛋白质、酱色、铁离子等引起的，目前还没有避免非生物浑浊的措施。因为黄酒酒体是一个很不稳定的胶体，其胶体的平衡会随着金属离子、温度、pH等因素的改变而受到一定程度上的破坏，导致其中的某些物质随之析出而形成沉淀[1]。蛋白质沉淀、氧化沉淀及铁沉淀等是非生物浑浊的主要类型，酒体中的蛋白质与多酚类的缔合反应被认为是产生非生物浑浊的主要原因[2]。近年来，关于蛋白质沉淀的研究越来越多，关于蛋白质沉淀机理的研究也有报道，综合和分析了目前关于蛋白质沉淀的研究报道，及目前用来解决非生物浑浊的方法。

1 蛋白质沉淀的影响因素

在氢键与疏水键的作用下，酒体中的蛋白质与多酚类物质发生缔合反应，这被认为是黄酒蛋白质沉淀的机理，从原理上来说此反应是可逆的，但所形成的缔合物在酒中溶解度较小，便会随着储存时间以及环境等因素的变化而慢慢从酒中析出。同时，在析出并沉降的过程中，酒体中的其它物质会因其沉淀效应而沉淀析出，导致黄酒中出现沉淀物[3]。研究发现，蛋白质含量及分子量分布、多酚、温度、pH、金属离子铁等对蛋白质沉淀有一定的影响。

1.1 蛋白质含量及分子量分布

黄酒的蛋白质含量在各种酿酒中是最高的，以多肽和氨基酸的形式存在，黄酒中蛋白质种类繁多，研究发现不同性质和分子量的蛋白质对黄酒沉淀的形成也有不同的影响。如朱建航等[4]对酒液及其沉淀物中的蛋白质进行隆丁区分发现，高分子蛋白质为引起蛋白质沉淀的主要原因。谢广发等[5]用凯氏定氮法测定酒体和酒脚的粗蛋白含量，利用隆丁法对酒体和酒脚的蛋白质进行区分，发现瓶装黄酒酒脚中粗蛋白质含量达50.6%，其中高分子蛋白所占比例为72.62%，是引起黄酒沉淀的主要原因。杨国军等[6]利用蛋白质分离检测仪对多种黄酒中的蛋白质进行分离检测发现，高分子蛋白质可导致黄酒产生浑浊沉淀，黄酒的稳定性与蛋白质总量无直接关系，而与特定蛋白质呈正相关，在低温下易使黄酒产生浑浊、沉淀。林峰等[7]用蛋白质分离检测仪测定和分析黄酒中蛋白质的含量和分子量与黄酒沉淀的相关关系发现，酒脚蛋白质的含量达到了50.2%，酒体中蛋白质分子量小于5 000的占52.65%，而酒脚中蛋白质分子量小于5 000的占19.32%，酒脚中高分子量蛋白质的比例很高，分子量大的蛋白质容易形成沉淀。高恩丽等[8]利用隆丁法对酒液沉淀物、冷沉淀物和酒液的蛋白质进行区分发现，低分子蛋白质在两种沉淀物中的比率均低于酒液中，低分子蛋白质在沉淀形成的过程中，所起的作用并不重要。由以上研究可看出，高分子蛋白质更易引起黄酒蛋白质沉淀。

1.2 多酚

多酚在蛋白质的表面结合，然后在蛋白质分子之间形成多点交连而形成网络结构，最终导致浑浊沉淀[9-11]。Siebert[12]提出了以下模式来解释蛋白质和多酚的结合反应：

当溶液中多酚的浓度低于蛋白质时，一个多酚应能在两个蛋白质分子中找到结合位点并与之形成类似“三明治”或“蛋白二聚体”的结构，由于多酚分子数量有限，从而不能再将它们连接起来，结果形成的胶体颗粒较小，浑浊量较少；（[多酚]＜[蛋白质]）。

图1 蛋白质-多酚的反应模型Fig.1 Reaction model of protein-polyphenol

增大多酚的含量，当多酚的含量增大到某一浓度时，此时多酚含有与蛋白质大体相等的结合点总数，就会形成多酚-蛋白质的交联网状结构，导致蛋白质更容易从溶液中沉淀出来；（[多酚]=[蛋白质]）。

继续增大多酚的量，同时降低了蛋白质的相对含量，这时多酚的羟基数多于蛋白质提供的结合点，蛋白质中几乎所有位点被占用，这样就导致一端已结合的多酚就难以在另一个蛋白质上找到位点与之结合，形成的沉淀反而减少[10]。（[多酚]＞[蛋白质]）。

白少勇[11]往黄酒中加入不同量的单宁溶液，结果发现当单宁加入量小于2.0 mg/mL时，蛋白质沉淀随着单宁加入量的增加而增加；当单宁加入量大于2.0 mg/mL时，蛋白质沉淀反而随着单宁添加量的增大而减少，这种现象也证实了上述模式。

1.3 温度

在黄酒存放过程中常见到这种现象：温度升高，黄酒产生热沉淀；而降低温度，酒体又会失去光泽并浑浊，但升温到室温后，酒体又会恢复清澈透明，这是冷浑浊。温度变化是促使黄酒蛋白质沉淀的主要因素之一。为了研究黄酒的热沉淀与冷浑浊，林峰等[7]做了加热和冷冻实验，结果发现，蛋白质受热变性聚合，从而增加了分子量大的蛋白质含量，而略微降低了分子量较小的蛋白质含量，降低了酒体中总蛋白质含量；黄酒经冷冻处理后，蛋白质与单宁的含量都降低了。从而得到了以下结论：蛋白质的受热变性聚合是引起黄酒热沉淀的主要原因，而蛋白质与单宁聚合物是引起黄酒冷浑浊的主要原因。

1.4 pH

蛋白质是带有正、负电荷基团的两性电解质，pH的不同会造成带电基团的电荷数量不同。白少勇[11]利用HCl和NaOH调节黄酒的pH，结果表明，黄酒中的蛋白质分布及含量会受到酒体的pH的影响，且受到的影响大小与pH变化大小呈正相关。因为黄酒含有种类众多的蛋白质，且各种蛋白质有着其特定的等电点，并不完全相同。当pH改变时，此时若某些蛋白质的等电点与pH接近，则蛋白质的净电荷几乎为零，蛋白质分子之间的静电斥力减弱甚至消失，胶体蛋白相互粘结，从而容易从酒体中凝聚析出。同时，析出的蛋白质增强了与其它蛋白质及细小微粒的结合能力，凝聚成越来越大的分子团而产生沉淀。

1.5 金属离子铁

黄酒中的铁来源于酒、原料及设备的腐蚀。一般认为黄酒中的铁大多以Fe3+形式存在，即使水及原料含有的铁以Fe2+形式存在，但接触空气后，Fe2+便被氧气氧化成Fe3+。黄酒中的磷酸遇到Fe3+便形成带负电荷的磷酸铁胶体，此胶体会和带正电荷的物质如蛋白质发生凝聚而沉淀。

而且黄酒中多种物质如蛋白质、有机酸等能与Fe3+结合，Fe3+也可催化其中一些成分的相互反应，如蛋白质与多酚的聚合、糖类与氨基酸的美拉德反应等，而储存时间的延长、温度的升高能加快上述反应的发生，结果大多生成难溶物或棕褐色的配合物，营养成分（如氨基酸）也随之被破坏[11，13]。实验证明[11]，Fe3+对黄酒蛋白质沉淀的影响很大，酒体中蛋白质含量随着Fe3+含量的增加而降低，Fe3+能促进蛋白质沉淀的形成，但其作用机制并不是Fe3+直接与蛋白质作用形成沉淀。

2 解决办法

研究和探讨黄酒的非生物浑浊问题的报道已有很多，并提出了相应的处理工艺，总结起来可分为过滤工艺处理法和澄清助剂处理法。

2.1 过滤工艺处理法

2.1.1 微滤法

微滤是通过微滤膜两侧的压力差来筛分溶液中的颗粒和大分子物质，从而达到过滤的效果。错流过滤是其中一种方式，液体以切线方向流过膜表面，故经过膜表面时，会产生剪切力，剪切力使沉积在膜表面的混浊颗粒扩散回主体流，这样膜表面污染层就能保持在一个较薄的稳定水平，避免出现快速堵塞的现象，故错流过滤法也可以对浑浊度较高的液体进行过滤。

谢广发等[14]用国产错流膜过滤装置过滤黄酒，比较不同孔径的膜过滤黄酒的效果。结果表明，经孔径为0.18 μm膜过滤后的黄酒的稳定性得到了明显的提高，黄酒的传统风味得到了保持；黄酒经0.18 μm膜处理后，蛋白质总含量下降了17.3%，除去的蛋白质分子量在5 000以上，降低了大分子蛋白质的比例，同时略微降低了总多酚含量。

2.1.2 超滤法

朱一松等[15]利用超滤技术处理纯生黄酒，结果表明：经超滤处理后，纯生黄酒中的酶（如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶）都达到了去除的要求，因酶本身可能引起的蛋白质沉淀就可以避免；蛋白质、多酚、铁离子、戊聚糖是黄酒非生物稳定性的影响因素，超滤处理后，其在纯生黄酒中的含量明显低于对照组，故在一定程度上提高了黄酒稳定性；经超滤处理后，纯生黄酒的平均粒度明显小于生黄酒，证明超滤技术可以提高纯生黄酒的非生物稳定性。

黄秀锦[16]以无机陶瓷膜超滤装置在20℃～25℃下过滤黄酒，对经过0.22、0.15、0.10 μm的膜过滤前后酒样进行总多酚、总蛋白质以及高、中、低分子蛋白质的含量比较，结果发现过滤后总酚的去除率分别为9.32%、11.86%、13.56%，总蛋白质的去除率为11.23%、14.66%、17.10%，其中高分子蛋白质的去除效果更为明显，去除率分别为45.5%、56.9%、69.1%，同时品尝了过滤前后的黄酒，结果发现黄酒经0.22、0.15 μm膜超滤处理后，香气变化不大，保持了黄酒特有的香味，且口味较清爽柔和，酒体协调。

2011年，郭晓明等[17]研究了超滤时间、超滤温度和不同操作压力对膜通量的影响，对超滤前后客家黄酒的冷浑浊情况进行了比较。结果表明，获得最佳膜通量的工艺条件为：超滤温度为30℃，操作压力为0.2 MPa，超滤时间为30 min，以此工艺处理黄酒后，黄酒中可溶性蛋白质含量有所下降，冷浑浊情况得到改善，黄酒品质得到提高。

2.1.3 微滤与冷冻处理

朱建航等[4]应用0.45 μm微滤膜处理5年陈黄酒液，对微滤前后酒样进行蛋白质隆丁分析，结果发现低、中、高分子蛋白质的含量均有所降低，其中高分子蛋白质的含量明显降低，高分子蛋白质含量的降低是酒体中总蛋白质含量减少的主要原因，而且即使贮存4个月后，微滤后的酒液的平均粒度仍维持94 mm，这明显小于微滤前的，从而说明经微滤技术处理后，黄酒的非生物稳定性得到了提高。

高恩丽等[18]分别应用微滤、冷冻、先微滤后冷冻和先冷冻后微滤处理黄酒，结果发现，虽然微滤和冷冻技术在一定程度上均提高了黄酒的稳定性，但微滤和冷冻技术相结合的处理效果更好，在蛋白质、铁、多酚的去除方面均有较好的效果，减少率分别达到7.64%～9.34%、25.8%～26.9%、22.9%～23.2%，在去除的蛋白质分子中，高分子蛋白质所占比例很大，其质量浓度从0.192 g/dL降低到0.14 g/dL，减少率达到了25%；同时对经微滤和冷冻相结合处理前后的黄酒进行口味和色度的比较，发现处理后的黄酒色度无明显变化，口味仍保持黄酒特有风味。

2.2 澄清助剂处理法

目前已有不少研究报道利用澄清助剂来处理黄酒非生物浑浊，目前生产厂家也常用此法来避免和减少黄酒非生物浑浊。从功能上来说，澄清助剂可分为以下四种类型：吸附型澄清助剂、酶制剂型澄清助剂、稳定型澄清助剂、复合型澄清助剂。

2.2.1 吸附型澄清助剂

吸附型澄清助剂，主要是利用助剂表面的吸附特性及所带基团和电荷与酒液中易引起浑浊的物质相互作用，并通过吸附作用而被除去，从而使酒体稳定性得到提高和改善。

2.2.1.1 植酸[19]

植酸有着以下特性：一是能除去酒中的金属离子，从而阻止金属离子与蛋白质和多酚物质等的缔合；二是能促进高级脂肪酸酯的絮凝。这样黄酒混浊的问题就得到了一定程度的解决，且能最大可能地减少酒中香味物质的损失，故植酸是一种比较理想的除浊剂。

朱强等应用植酸、膨润土、活性炭和酒用酸性蛋白酶来处理黄酒浑浊，比较得出最佳除浊剂为植酸。用0.04%植酸在常温下处理黄酒24 h，黄酒除浊效果最佳，且除浊过滤后的黄酒澄清透明，色香味均优于对照，稳定性也得到了一定的提高和改善。

2.2.1.2 单宁酸

单宁酸是一类分子量大的复杂多元酚类化合物，分子中含有大量酚羟基，在氢键或疏水键的作用下，在酸性环境下能与蛋白质和多酚结合，从而固定在蛋白质的分子上，使单宁酸的疏水部分朝向水和乙醇介质，生成不溶性单宁酸-蛋白质复合物，滤除此物，即可提高酒液的稳定性[3，20]。

2002年黄国柱等[20]比较了不同量的单宁酸预防黄酒非生物浑浊的效果，结果发现，0.007%单宁酸的处理效果最佳，用量不足则澄清效果欠佳，过量则出现涩味。并进行了生产试用，即按照0.007%的用量称取单宁酸，用温水溶解后，加入黄酒中，边加边搅拌均匀，自然澄清5 d～7 d后，过滤、灌装、灭菌，处理后的黄酒，其浑浊得到了明显的延缓，稳定性也得到了大大的提高。

2.2.1.3 PVPP[22]

国内外已广泛利用PVPP吸附剂来提高葡萄酒的稳定性[21]，PVPP提高酒稳定性的原理主要是对酒中单宁的特征吸附。PVPP分子结构中具有羰基，易与羟基通过氢键结合，而酚羟基因其氧原子与苯环上的碳形成共轭大π键，其氢原子更容易与PVPP上的羰基形成氢键，所以PVPP对含酚羟基的物质如单宁有特征吸附。

PVVP搅拌吸附黄酒的最佳工艺条件如下：在温室下，用量以0.6 mg/mL～0.8 mg/mL为宜，吸附搅拌时间为30 min～60 min。按最佳工艺条件处理新酿制的和1年左右酒龄的黄酒，通过自然存放法对其稳定性进行试验。结果表明，新酒存放6个月，1年酒龄的酒存放12个月，肉眼基本观察不到浑浊物质。在黄酒的稳定期，基本未出现冷浑浊现象。

2.2.1.4 酒类专用活性炭[23]

酒类专用活性炭提高黄酒稳定性的作用机理有两个方面。一是利用其独特的多孔结构所产生的吸附作用；二是其表面含有氧、氢、氮等元素，它们对活性炭的吸附特性及其它特性有较大影响。实验表明，黄酒经酒类专用炭处理后，除酒的浊度有所降低外，其余指标保持不变。对处理前后酒样的稳定性进行比较，发现经酒类专用炭处理后，黄酒沉淀减少，还可以延迟沉淀的发生。但缺点是操作时活性炭污染较为严重，还有炭的吸附性导致澄清罐罐壁上会吸附一层炭，给罐的清洁带来一定困难。

2.2.2 酶制剂型澄清助剂[3]

蛋白酶将发酵不彻底的蛋白质分解为多肽、氨基酸等小分子物质，降低蛋白质的含量，减少沉淀的形成量，延缓浑浊的产生，这是酶制剂型澄清助剂的作用原理。酸性蛋白质推荐用量为10 mL/kL～20 mL/kL，作用温度为45℃～70℃，pH为4～6。但添加酶制剂时不能过量，否则会产生新的不稳定性因素。

2.2.3 稳定型澄清助剂

酒体中的Fe3+和氧气能促进黄酒的非生物浑浊，但一般很难从酒中除去，若在酒液中添加稳定性助剂，则黄酒沉淀的现象可减缓或去除。Fe2+转化为Fe3+是黄酒产生铁混浊的前提，通过添加抗氧化剂于酒中或减少瓶颈空气，即可降低酒液氧化还原电位，铁浑浊的产生也得到一定的减缓。在酒液中添加抗坏血酸、异抗坏血酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸，可有效防止铁浑浊的发生，又不影响酒质[24]。

铁配合剂可与铁螯合，形成稳定的配合物，从而防止铁浑浊的发生，已应用于黄酒稳定性的提高上。如柠檬酸，其应在杀菌加热前添加，推荐用量为0.01%～0.05%；也可用 EDTA，用量为0.1 mmol/L～5 mmol/L；卡拉胶、美国硅胶也是对酒体稳定性有较大作用的助剂[3]。

2.2.4 复合型澄清助剂

单独使用以上所述的几种澄清助剂，虽然在提高黄酒的非生物稳定性有一定的效果，但影响黄酒非生物稳定性的因素众多，所以黄酒非生物浑浊得不到彻底解决。因而，目前已有人依据黄酒非生物浑浊的影响因素，采用多种澄清助剂，并结合适当的处理方法与工艺，来更好地解决此问题。如单宁-皂土法、澄清剂+膨润土处理法、DHG澄清剂法等。

明胶是一种水溶性蛋白质，其溶于水后以带有正电荷的粒子形式存在，能吸附酒体中带负电荷的粒子而形成沉淀。而皂土吸水膨胀后以带有负电荷的胶体粒子形式存在，能吸附酒体中带正电荷的粒子而出现沉淀。因此，明胶与皂土结合处理黄酒，酒体中过量的明胶还可被皂土除去。但是皂土的使用对黄酒的口味及色泽有一定的影响[25]。

代同现等[26]用0.5%101澄清剂和膨润土结合处理黄酒，并对处理后的黄酒进行稳定性试验，结果表明：黄酒经处理后，口感更加柔和、鲜爽；即使在冰柜中冷冻到该酒冰点一周，酒样中未观察到浑浊沉淀现象；将酒样加热至85℃～90℃，并在此温度下保持15 min，冷却后，未观察到失光浑浊现象；在酒样中添加与黄酒本身电荷不同的胶体溶液，充分摇匀后，酒样无任何失光浑浊现象。

刘慧杰等[27]结合植酸澄清助剂、冷冻、加热三种方法来处理黄酒，并通过响应面法来优化处理条件，得到的最佳工艺条件为：冷冻温度-5℃，植酸浓度为0.02%，加热温度为87℃。以最佳工艺处理黄酒沉淀，明显提高了酒样的非生物稳定性，且浊度比处理前降低大约5倍。

DHG澄清剂[28]是由DHG、海藻酸丙二醇脂、膨润土和硅藻土等所组成，是一种复合型澄清剂，其作用机理是迅速溶解于黄酒而形成带正、负电荷的球状绒体，正负电荷的吸引促进了酒体中蛋白质-多酚的缔合及分子间的布朗运动，加剧了分子间的相互碰撞，使不易沉淀的小分子结合成大分子而形成絮凝沉淀，从而提高酒体稳定性。且其独特的DHG成分可选择性地吸附大量大分子蛋白多酚，保留了具有还原性能力的小分子蛋白多酚，增强了酒体的抗氧化能力，提高了黄酒的非生物稳定性和风味稳定性。研究发现，用300 mg/kg的DHG澄清剂在黄酒中除浊，用软水溶解澄清剂，再加入酒中并搅拌均匀，冷冻静置24 h后，经过滤、灭菌和灌装，降低了黄酒中的总氮和固形物含量，提高了黄酒对蛋白质的稳定性，同时改善了黄酒的感官质量。

3 展望

蛋白质沉淀是引起黄酒非生物浑浊的主要原因，解决了蛋白质沉淀问题，也就从很大程度上解决了黄酒的非生物浑浊问题。但目前针对非生物浑浊的研究篇幅较多，但对蛋白质沉淀的研究相对较少，对蛋白质沉淀机理的研究还不是很透彻。随着对黄酒蛋白质沉淀的了解加深，黄酒蛋白质沉淀问题，甚至黄酒非生物浑浊沉淀问题也将会得到突破性的进展。

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