高密度二氧化碳杀菌蛋白液贮藏期间微生物和理化功能性质变化

刘文营

（国家蛋品工程技术研究中心，北京102115）

对蛋白液的杀菌方式通常采用的是巴氏杀菌，巴氏杀菌对食源性致病菌具有良好的杀灭效果，但是高温杀菌处理常常会影响食品的营养价值、感官品质和功能性质，特别是在较低温度下就会发生变性的物料，因此，非热杀菌技术得到越来越广泛的研究和应用。

高密度二氧化碳技术（DensePhaseCarbonDioxide，DPCD）是一种新型的冷杀菌技术，其在食品加工过程中可最大限度的保留食品中的有益成分，是一种绿色洁净技术。其利用二氧化碳的化学惰性、无腐蚀性、高挥发性、独特的经济性和在高压条件下具有的杀菌作用[1-2]，来对物质在相对较低温度下进行杀菌或钝酶，可以最大限度地保持食品营养、风味和新鲜度等品质[3-8]，且不会影响食品安全性。

在对DPCD对微生物的作用效果研究时，Spilimbergo[9]、Murat[10]和 Liao[11]等的实验结果均显示，所采用的处理压力越大，对微生物的钝化、致死能力越强。本文设计了一组实验，分别对蛋白液进行不同的压力和时间的处理，然后在4℃条件下贮藏，对1到4周贮藏期间蛋白液的微生物增殖和理化功能性质的变化进行了分析。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

分离当天鲜蛋蛋白液后用匀浆器匀浆，然后分成10组，每组5份样品，一组为空白对照，将处理后的蛋白液贮藏在4℃层析柜，处理条件见表1。

表1 不同杀菌处理条件Table 1 Different sterilization conditions

CO2（纯度：99.5%，北京千禧京城气体有限公司）；Tris、Glycine、DTNB、EDTA（Amresco，美国）；ANS、Urea（Sigma，美国）；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

F6/10-10G超细匀浆器：上海FLUKO流体机械制造有限公司；WBN-5/50型DPCD杀菌机：温州贝诺机械有限公司；LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；YT-GJ-2ND型超净工作台：北京亚泰科隆仪器技术有限公司；SL-Ⅲ层析柜：北京松源华兴科技发展有限公司；XYF2-40-H型纯水机：北京湘顺源科技有限公司；DRP-9162型电热恒温培养箱：上海培因实验仪器有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计：SHIMADZU，JAPAN；Eclipse spectrofluorimeter荧光可见分光光度计：美国Cary公司；万分之一电子天平：梅特勒公司；PH211台式酸度计：意大利哈纳科仪公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白液高密度二氧化碳处理

首先，开启冷却器和恒温水浴使其达到设定温度；之后，开启水浴循环使处理釜达到30℃，将样品放进处理釜后密封，然后开启增压泵泵入CO2，待温度和压力达到预设条件后维持相应时间，处理条件完成后卸压取出样品。

1.3.2 微生物计数

参考国标进行微生物平板菌落计数[12-14]。将菌液用0.85%生理盐水以10倍稀释法进行逐级稀释，根据细菌数量选择合适的稀释度进行逐级稀释，吸取连续3个不同稀释度的稀释样1.0 mL于灭菌平皿中，倒入约15 mL营养琼脂培养基或者选择性培养基，摇匀后分别于30℃（大肠杆菌）、37℃（沙门氏菌、菌落总数）下培养48 h后计数。每个稀释度做三个平行。

式中：T 为 2.303；D 为稀释倍数，100；c为蛋白质的浓度，0.2%；φ为油相所占的体积分数，25%。1.3.5 pH的测定

pH计经7.01和10.01的标准液校准后，直接进行pH测定。

1.3.6 表面疏水性

采用荧光探针ANS法[17]。用10 mmol/L的缓冲溶液（pH 7.0）配制不同浓度的蛋白溶液（0.005%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%和0.2%）和8 mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8naphthalene-sulfonate，ANS）溶液。检测前取20 μL ANS溶液加到4 mL蛋白质溶液中，混合均匀，迅速测定混合液的荧光强度（Fl’）及未加ANS溶液的样品荧光强度（FI0）。激发波长为390 nm，发射波长为470 nm。Fl’与FI0的差值记为Fl，以蛋白质浓度为横坐标，Fl为纵坐标作图，曲线的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数H0。

1.3.7 自由巯基含量

方法[18]，蛋白溶液与Tris-Gly缓冲液（0.086 molTris，0.09 mol/L Gly，0.04 mol/L EDTA，8 mol/L

式中：N为样品中菌落总数，CFU/mL；∑C为平板菌落数之和；n1为第一稀释度平板个数；n2为第二稀释度平板个数；d为稀释因子（第一稀释度）。

1.3.3 起泡能力变化

参考文献方法[15]，并进行了修改。取4 mL蛋白液，加入蒸馏水定容至50 mL（H0），倒入250 mL烧杯中，于超细匀浆器上以104r/min的转速每隔30 s搅拌均质1次，均质4次后，快速转移至50 mL量筒，记下液体高度（H1）。蛋白溶液起泡能力大小的评价用泡沫高度即（H0-H1）表示，每个样品做3次重复。

1.3.4 乳化能力变化

参考文献中的方法进行乳化性能（emulsifying activity index，EAI）的测定[16]。

将各样品用缓冲溶液配制成终浓度为0.2%的蛋白样品，取2 mL色拉油与6 mL待测溶液混合，然后104g均质1 min，然后立即从底部取50 μL，用含有0.1%的SDS的缓冲溶液稀释成5 mL，震荡后立即测500 nm下的吸光值A0。Urea）混合，10 000 g离心10 min，取上清液测游离巯基（SHF）含量。

游离巯基（SHF）含量：取2 mL上清液加入80 μL Ellman's试剂（4 mg/mL，DTNB（5，5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）），立即混匀，5 min后在λ=412 nm下测吸光度值（A412）。

巯基的计算公式如下：

式中：73.53=106/（1.36×104），1.36×104是Ellman's试剂的摩尔消光系数；A412为λ=412 nm下吸光度值；C为样品的蛋白质浓度，（mg/mL）。

2 结果与分析

2.1 贮藏期间微生物数量变化

对9组处理的样品和未处理原样进行大肠杆菌和沙门氏菌的选择性培养基培养，均无菌落生成。

对蛋白液在贮藏期间的微生物数量的变化比较，结果如图1所示。

图1 贮藏期间微生物数量变化图Fig.1 Microbial quantity variation during storage

单独进行同一时间杀菌效果分析时，结果显示高密度二氧化碳对微生物具有致死作用，且在10 MPa时，随着处理时间的延长，微生物数量减少的越多，其他处理均没有或者只有很少数量的微生物存在。随着贮藏时间的延长，微生物数量呈现逐渐增加的趋势，10 MPa，10 min条件处理下，微生物数量最多，增加的趋势也最快。

单独考虑杀菌处理对微生物的致死作用时，Spilimbergo[9]、Murat[10]和 Liao[11]等的结果均显示，压力越大，对微生物的钝化、致死能力越强，与本实验结果具有一致性。

2.2 pH的变化

DPCD处理时通入大量的CO2，在物料内形成高压高酸的环境，来达到致死、钝化微生物的目的。杀菌处理后的蛋液的pH会有一定的降低，一方面是高压高酸处理导致的蛋白溶液基质的变化，另一方面是残留的CO2，其中后者占主要地位。DPCD对蛋白液的pH的影响结果如图2所示。

图2 贮藏期间蛋白液pH变化图Fig.2 Protein liquid pH variation during storage

在对物料进行处理时，由于在处理过程中，二氧化碳大量渗入到液体中，使得液体酸度降低，处理结束后泄压的时间和速度不同，残留的二氧化碳也不同，这也就是结果中pH的规律性不强的原因，随着贮藏时间的延长，残留CO2的减少，杀菌处理对蛋白液的性质的影响减弱，蛋白液的pH逐渐增加，到第4周时达到和初始的pH相当的水平。

当用DPCD处理苹果汁等其它物料时，结果也显示物料酸度会降低[11]。

2.3 疏水性

图3 贮藏期间蛋液疏水性变化图Fig.3 Egg white protein hydrophobic variation during storage

蛋白质氨基酸残基的疏水性是影响蛋白质溶解性、结构和结合脂肪能力的一个重要因素。蛋白质的疏水自由能也是影响蛋白质结构稳定性的重要因素。由图3可知，高密度二氧化碳处理后蛋白液的疏水性明显降低，且在贮藏期间疏水性指数随着时间的延长而增加。9组处理样品的疏水性指数在不同贮藏期，基本保持在一个相似大小的水平上。第4周和第3周的疏水性指数基本一致，说明从第3周开始蛋白的疏水性指数变化不大。

疏水性受蛋白体系的酸碱度影响，蛋白液是一个复杂的体系，二氧化碳处理使得酸碱度降低，且不同处理蛋白具有不同的表观形态，也就使得疏水性呈现相对不规律的变化，但在贮藏期间内呈现增加的趋势。

2.4 表面巯基含量

表面巯基是亲水性巯基，一般情况下表面巯基含量与疏水性的变化趋势大致呈现相反的趋势，而当高密度二氧化碳处理时，促使了蛋白液蛋白性质发生了变化，包括溶解性增加、可溶性蛋白含量增加等，使得蛋白液在疏水性强度增加的情况下巯基含量也增加。表面巯基含量表达的是分子间作用力的变化，与凝胶强度相关。

表面巯基的变化如图4所示。

图4 贮藏期间蛋白表面巯基含量变化图Fig.4 Egg white protein surface sulfhydryl content variation during storage

第1周数据显示在10 MPa压强下呈现降低的趋势，20 MPa和30 MPa条件下，均呈现先增加后降低的趋势，与同等时期蛋白疏水性降低后增高的趋势相反。在后期贮藏期间，随着时间的延长，二氧化碳的散失，指数基本保持在相似的水平上，整体差异不大。

贝君等[19]利用高密度二氧化碳处理脂肪酶时，结果显示脂肪酶的巯基含量随着处理压力的增加而增加，与本实验结果具差异性。可能为蛋白液和脂肪酶的状态不一样，影响了高密度二氧化碳的处理效果，但均具有处理后巯基含量增加的现象。

2.5 处理前后蛋白液的乳化活性变化

蛋白液贮藏期间乳化性的变化如图5所示。

图5 贮藏期间蛋液乳化性变化图Fig.5 Egg white emulsification variation during storage

经过不同条件处理的蛋白液乳化性呈现不同的趋势，整体与未经处理的蛋液差异较大。第1周结果显示，在10 MPa压力处理下，乳化性随着处理时间的增加乳化活性下降，而在20 MPa和30 MPa条件下，则随着时间的延长，乳化性呈现增加的趋势，第2周的数据基本保持第1周的趋势，但整体乳化性增强，从第2周开始，乳化性的变化趋势开始变缓，逐渐向同一水平靠拢，趋于增加。蛋白液蛋白的乳化性指数大小是蛋白整体乳化活性的反映，同蛋白液的疏水性和巯基含量变化的趋势相似。

结果说明处理压力和贮藏时间均影响蛋液的乳化性，且乳化性随着贮藏时间的延长而变化，液体内残留二氧化碳的不同可能也会导致乳化活性的不同和影响蛋液乳化性的规律性变化。

2.6 蛋白液的起泡能力变化

图6 贮藏期间蛋白液的起泡能力质变化图Fig.6 Egg white foaming capacity variation during storage

图6 中蛋白液的起泡能力变化结果显示，单独考虑某一时期蛋白液的起泡能力变化时，蛋液的起泡能力与表面巯基的含量变化趋势相反，和表面疏水性的变化趋势相似，蛋白质的起泡能力也和表面巯基有一定的关系[20-21]。

蛋白液的起泡能力随着时间的延长整体呈现增加的趋势，且在第4周时明显表现出，随着同一压力下，随着处理时间的延长蛋白质的起泡能力减弱，处理压力增加起泡能力也减小。

3 结论

随着贮藏时间的延长，在初始微生物总数的基础上，微生物数量呈现不同程度的增加，到第4周时，1到4号样品均检测到微生物生长，5到9号样品则没有检测到微生物。

在贮藏期间内，蛋白液中残留二氧化碳的释放，使得蛋白液的pH呈现增加的趋势，到第4周时，基本恢复到处理之前的数值大小。疏水性指数变大和表面巯基含量先增加后降低，都是趋于恢复到初始大小的趋势。

10 MPa压力处理蛋白溶液的乳化性，随着时间的延长呈现整体降低的趋势，20 MPa压力处理的蛋液的乳化性基本保持不变，30 MPa压力处理蛋液的乳化性增加，整体呈现随着压力和处理时间的延长乳化性变强的趋势；蛋白液的起泡能力随着贮藏时间的延长而增加，第4周时，表现为随着处理压力和时间的增加起泡能力降低的趋势。

针对高密度二氧化碳处理影响蛋白液功能性的机理和影响方式，至今还不清晰，尚需更深入的研究。同时，在进行高密度二氧化碳处理样品的制备上还需进一步完善，以降低二氧化碳残留对量等对结果有影响的因素的影响。

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