半仿生提取柿叶黄酮及其抗氧化和抗菌作用

孙彩云，柳鑫华，王庆辉，李媛媛，张飞龙

（河北联合大学轻工学院，河北唐山063000）

柿叶是柿属植物柿的叶片，柿子在我国各地普遍栽培，约40多种，京津唐地区以磨盘柿闻名。柿果、柿蒂、柿花、柿叶、柿根皮均可入药。柿叶味苦、性寒，作为药用始载于明代《滇南本草》[1]。《本草再新》记载柿叶可“治咳嗽吐血，止渴生津”。20世纪80年代起柿叶茶风靡日本，他们认为常饮柿叶茶，对高血压、脑溢血、糖尿病的防治有较好疗效。柿叶在印度传统医药中也被广泛应用。柿叶中含有叶绿素、黄酮、VC、β-胡萝卜素、生物碱、氨基酸等多种营养物质和生物活性物质[2-3]，黄酮是其主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗突变、抗肿瘤等多种作用。半仿生提取法[4]是为经消化道的中药试剂设计的一种提取工艺，即模拟口服给药及药物经胃肠道转运的原理，采用不同pH的酸性水和碱性水依次连续提取，其目的是尽可能地提取和保留原药中的有效成分。从柿叶提取黄酮可变废为宝，提高其开发利用价值。

1 材料与方法

1.1 原料

磨盘柿叶（采集于河北遵化，干燥、粉碎，过40目筛备用）。

1.2 仪器及试剂

主要仪器：752紫外-可见分光光度计（杭州）；HH-8恒温数显水浴锅（江苏金坛）；BS124S电子天平（赛多利斯）；DELTA 320酸度计（成都）；800型离心机（江苏金坛）；恒温培养箱（长沙）；烘箱（宁波）；层析柱（30×300 mm，上海）。

主要试剂：NaOH、盐酸、芦丁（BR，标准品，含量≥95%）、氯化铝、无水乙醇、D101大孔树脂、KH2PO4、K2HPO4、NH4Cl、VC、H2O2、豆油、氯仿、冰醋酸、KI、淀粉、邻二氮杂菲、硫酸亚铁铵、1，1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH）、邻苯三酚、琼脂、白葡萄菌、大肠杆菌、氨水，以上无特殊说明均为分析纯。

1.3 芦丁吸取曲线和标准曲线

分别吸取 50 μg/mL 的芦丁标准溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5支10 mL比色管中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀。以试剂空白作参比，在220 nm～400 nm扫描，绘制吸收曲线和标准曲线。

1.4 柿叶黄酮半仿生法提取

根据仿生学原理，人体胃、小肠、大肠的体液pH分别为 0.9～1.5、7.6、8.3～8.4。准确称取 2 g 柿叶粉，依次加入pH≈2.0的盐酸溶液，pH≈7.5和pH≈8.5的氨-氯化铵缓冲溶液作为提取液，在一定的温度下回流提取一定时间，合并三次提取液，用70%乙醇定容至150 mL，摇匀，准确吸取1.0 mL稀释至50 mL，以70%乙醇做参比，在λmax处测定其吸光度A值。选取提取温度，提取时间，固液比等三因素，进行正交试验设计，优选半仿生法提取工艺条件。

1.5 柿叶黄酮的抗氧化能力的测定

柿叶提取液经D101大孔树脂进行精制，树脂的预处理参考文献[2]。采用湿法装柱，充分吸附后先用水洗，然后收集70%乙醇洗脱液，干燥后得柿叶总黄酮提取物，用于抗氧化实验。

1.5.1 柿叶黄酮对DPPH自由基的清除作用

分别取1%柿叶黄酮溶液和1%VC溶液1.0 mL，置于10 mL比色管中，加入3.0 mL 0.04 mg/mL的DPPH乙醇溶液，室温避光反应30 min，同时以无水乙醇为空白，于517 nm处测定吸光度A值，按下列公式计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为1.0 mL蒸馏水+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值；As为1.0 mL样品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值；Ac为1.0 mL样品溶液+3.0 mL无水乙醇的吸光度值。

1.5.2 柿叶黄酮对羟基自由基的清除作用

取3支10 mL比色管分别加入7.5 mmol/L邻二氮杂菲溶液0.2 mL，加入7.5 mmol/L硫酸亚铁铵溶液0.2 mL，加入pH≈7.4磷酸盐缓冲溶液1 mL，在2，3号比色管加入7.5 mmol/L双氧水1.0 mL，在3号比色管中再加入1.0 mL柿叶黄酮溶液，用去离子水定容至刻度，在37℃水浴中反应1 h，冷水冷却，以水为参比，在508 nm处测其吸光度值，计算清除率。

式中：A1为不加双氧水和黄酮的吸光度值；A2为只加双氧水的吸光度值；A3为双氧水和黄酮均加的吸光度值。

1.5.3 柿叶黄酮对超氧自由基的清除作用

取3 mL pH≈8.0的磷酸盐缓冲溶液于10 mL比色管中，置于25℃水浴中预热20 min，分别加入同体积不同浓度的待测液溶液和0.6 mL 30 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中预热5 min，加入0.5 mL 1 mol/L HCl终止反应，于420 nm处测定吸光度值A1。以同体积的去离子水代替样品，吸光度记为A0，作空白对照。考虑到待测液本身可能在420 nm处有吸收，用同体积的去离子水代替邻苯三酚溶液，得A2，计算清除率。

1.5.4 柿叶黄酮抗油脂过氧化作用

食用油中过氧化物在氯仿-冰醋酸介质中，与KI作用定量产生I2，可用淀粉溶液直接显色，于585 nm处进行定量分析。实验方法：取4个干净烧杯，各加入20 g的大豆油，1号加入5 mL去离子水，2号加入5 mL 1%柿叶黄酮溶液，3号加入5 mL 1%VC溶液，4号加入5 mL 2%的柿叶黄酮溶液，充分搅匀后于60℃烘箱内，每24 h搅拌一次使其均匀，测量一次A值。

测定方法：精密称取0.2 g豆油于10 mL比色管中，加2.5 mL（2+3）氯仿-冰醋酸溶解，加入0.1 mL KI饱和溶液，塞紧振荡30 s，在暗处放置3 min，加1.0 mL淀粉溶液，稀释至刻度，摇匀静置5 min，以试剂空白（不加油样，其余均加）为参比，于580 nm处测定A值，见图3。

1.6 黄酮提取物抑菌性实验方法

取1 cm的圆形纸片6片，其中两片（1号、2号）放入1%黄酮提取液中浸泡6 h，另取两片（3号、4号）放入1%VC溶液浸泡6 h，其余两片（5号、6号）放入蒸馏水中浸泡6 h。在无菌操作台上分别将1号、3号、5号置于在大肠杆菌培养皿中，将2号、4号、6号置于白葡萄菌培养皿中，于37℃恒温箱中培养24 h后，测定抑菌圈直径，结果见表5。

2 结果与分析

2.1 吸收曲线和标准曲线

芦丁（乙醇溶液）吸收曲线和芦丁标准曲线见图1、图2。

由图1吸收曲线可知芦丁在272 nm有最大吸收，选择272 nm作为测定波长。

图1 芦丁（乙醇溶液）吸收曲线Fig.1 Absorption curve of Rutin（in ethanol）

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin

标准曲线回归方程：A=33.3C+0.029 5，相关系数r=0.999 8，芦丁浓度在0～0.025 mg/mL范围内线性较好，可据此进行定量分析。

2.2 半仿生提取法正交试验结果

半仿生法提取柿叶黄酮的正交试验结果见表1。

表1 半仿生法正交试验结果Table 1 Results of orthogonal experiment for semi-bionic extraction

正交试验结果表明最优组合为A3B2C3，即半仿生法提取柿叶黄酮的最佳工艺条件为：固液比为1∶20，提取温度80℃，时间1 h。影响因素主次顺序为固液比＞温度＞回流时间。

2.3 柿叶黄酮抗氧化作用的实验结果

自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。损害人体健康的主要是活性氧自由基，如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基二氧化氮和一氧化氮自由基等。DPPH就是一种很稳定的氮中心的自由基，广泛用于测定生物试样和食品的抗氧化能力。

2.3.1 黄酮提取液对DPPH自由基的清除率

柿叶黄酮对DPPH自由基的清除作用结果见表2。

表2 对DPPH自由基清除实验结果Table 2 Results on scavenging DPPH free radical

结果表明柿叶黄酮有较高的抗DPPH自由基能力，其清除率略高于VC。

2.3.2 黄酮提取液对羟基自由基的清除率

柿叶黄酮对羟基自由基的清除作用结果见表3。

表3 对羟基自由基的清除实验结果Table 3 Results on scavenging hydroxyl radical

表3数据表明柿叶黄酮溶液对羟基自由基的清除能力低于VC溶液。

2.3.3 黄酮提取液对超氧阴离子的清除率

柿叶黄酮对超氧自由基的清除作用结果见表4。

表4 清除超氧自由基实验结果Table 4 Results on scavenging superoxide free radical

通过对比发现，柿叶黄酮溶液对超氧自由基的清除作用高于VC。

2.3.4 柿叶黄酮对大豆油的抗氧化作用

柿叶黄酮对大豆油的抗氧化作用结果见图3。

图3 柿叶黄酮对大豆油的抗氧化作用Fig.3 Antioxidant effect of flavonoid extracted from persimmon leaves on soybean oil

去离子水没有抗氧化作用，作为参照。由图3可知，同浓度的柿叶黄酮溶液抗豆油过氧化作用优于VC。且浓度增大，抗油脂过氧化作用增强。

2.4 柿叶黄酮提取物抑菌作用实验结果

柿叶黄酮对白葡萄菌和大肠杆菌的抑制作用结果见表5。

表5 抑菌直径Table 5 Bacteriostatic diameter cm

水对白葡萄菌、大肠杆菌均无抑菌作用，作为对照。一般认为抑菌圈＜0.8 cm为不敏感；0.8 cm～1.3 cm为低度抑菌、1.3 cm～1.9 cm为中度抑菌、＞1.9 cm为高度抑菌。实验结果表明：柿叶黄酮溶液对两种菌类均有中度抑菌作用，且均强于VC。

3 结论

1）采用半仿生法提取磨盘柿叶中总黄酮，用pH分别为2.0、7.5和8.5的水溶液为提取剂各提取一次，最佳提取条件为：提取温度80℃，时间1 h，固液比为1 ∶20。

2）柿叶总黄酮表现出较好的抗油脂过氧化和清除自由基作用。其对DPPH自由基清除率为77.44%，对超氧自由基清除率为78.08%，均优于VC；对羟基自由基清除率为55.67%，低于VC。柿叶黄酮溶液对供试的白葡萄菌、大肠杆菌均有中度抑制作用，抑菌直径分别为 1.5 cm、1.7 cm，均高于 VC。

磨盘柿叶总黄酮具有良好的抗自由基、抗油脂氧化及抑制白葡萄菌、大肠杆菌生长作用，可用作天然抗氧化剂、防腐剂，在食品、化妆品、药品行业具有广泛的开发前景。

[1]马新博,宫汝飞.柿叶黄酮药理作用研究进展[J].中医药学报,2012,40(4):130-132

[2]董江涛,李燕,徐慧强,等.大孔树脂纯化柿叶总黄酮的工艺研究[J].湖南农业科学,2010(11):85-89

[3]赵喜红,何小维,罗志刚.柿叶黄酮类物质的乙醇提取工艺及其抗氧化性的研究[J].食品研究与开发,2007,28(3):49-53

[4]陈丛瑾,黄克瀛,李德良.正交试验法优选香椿叶总黄酮的半仿生提取工艺[J].食品科技,2007(6):119-121

[5]文镜,贺锁华,杨育颖.保健食品清除自由基作用的体外测定方法和原理[J].食品科学,2004,25(1):75-78

[6]马文兵,李红鹏.连翘叶体外抑菌作用的实验研究[J].时珍国医国药,2013,24(2):379-380