氯化锌对紫外线损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用△

杜宇翔 郭大东 唐凯 司俊康 沙芳 毕宏生

氯化锌对紫外线损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用△

杜宇翔 郭大东 唐凯 司俊康 沙芳 毕宏生

锌离子；晶状体上皮细胞；紫外线；caspase-12

目的研究适当浓度的ZnCl2对紫外线(ultraviolet B，UVB)损伤的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell，HLEC)的保护作用及其作用机制。方法用MTT法检测空白对照组、单纯紫外照射组和2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1ZnCl2预处理后UVB照射(实验组)HLEC B-3的生存率； 实时细胞电子分析系统(RT-CES)动态监测ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)预处理对UVB照射后HLEC B-3细胞增殖的影响；DAPI染色法检测各组细胞核的变化；实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HLEC B-3中caspase-12 mRNA和蛋白质表达的变化。结果MTT结果表明，单纯紫外照射组和ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)预处理实验组24 h细胞生存率分别为34.47%±9.31%、65.91%±12.46%、64.30%±16.24%和46.36%±6.28%；48 h细胞生存率分别为8.31%±1.38%、53.82%±11.34%、59.25%±7.58%和36.57%±8.41%；72 h细胞生存率分别为6.75%±3.71%、48.29%±10.06%、56.53%±8.47%和39.57%±8.93%。RT-CES分析结果显示，ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)预处理可抑制UVB照射诱发的HLEC B-3的坏死和凋亡；DAPI染色结果表明，ZnCl2可减少UVB照射引起的HLEC B-3细胞核固缩和碎裂；RT-PCR和ELISA检测结果表明，ZnCl2可抑制UVB照射诱发的caspase-12 mRNA和蛋白质的表达升高。结论适当浓度的ZnCl2可抑制UVB照射后HLEC B-3中caspase-12的表达上调，进而对体外培养的HLEC B-3细胞UVB损伤起到保护作用。

[眼科新进展，2014，34(5)：405-409]

锌离子是机体重要的微量元素，参与了多种酶功能的调节，同时对千余种转录因子的结构和功能起调控作用[1]。前期的研究结果表明，锌离子浓度的升高可以抑制细胞凋亡，对双氧水[2]和高糖[3]引起的氧化应激细胞损伤具有保护作用。紫外线(ultraviolet B，UVB)照射引发的细胞损伤本质上也是一种氧化应激。晶状体上皮细胞是位于前囊下的单层上皮细胞，为晶状体的生长和分化提供能量，同时参与晶状体的损伤修复，与白内障的发生发展密切相关。本研究将就ZnCl2对UVB照射后的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell，HLEC)B-3的保护作用及其相关机制进行研究，以期对后续的研究工作提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器HLEC B-3(美国ATCC)；胎牛血清、改良型RPMI-1640培养基、2.5 g·L-1胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2～7.4)(美国 Hyclone公司)；DAPI(武汉博士德生物工程有限公司)，MTT(碧云天生物技术研究所)；TRIpure Reagent RNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)；caspase-12及GAPDH上下游引物(上海生工生物工程有限公司)；人caspase-12酶联免疫分析试剂盒(武汉基因美生物技术有限公司)。实时荧光定量PCR(MX3000P，美国Agilent公司)；酶标仪(美国BioTek公司)；荧光显微镜(IX71型，日本Olympus公司)；微量紫外分光光度计(K5600型，北京凯奥科技发展有限公司)。

1.2方法参照庄晓东等[4]的方法进行传代培养HLEC B-3细胞株。培养液为含有青-链霉素、体积分数10%胎牛血清的改良型1640细胞培养液。细胞培养于37 ℃、含体积分数5%CO2的恒温培养箱。取对数生长期细胞随机分为3组：(1)空白对照组：HLEC B-3未加入ZnCl2预处理，未经UVB照射；(2)单纯紫外照射组：HLEC B-3未加入ZnCl2预处理，弃除绝大部分细胞培养液，仅余少许等量培养液以防细胞干涸，40 mJ·cm-2UVB照射细胞；(3)ZnCl2实验组：HLEC B-3分别用2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1的ZnCl2预处理2 h后，弃除绝大部分细胞培养液，仅余少许等量培养液以防细胞干涸，40 mJ·cm-2UVB照射细胞(UVB照射强度和ZnCl2处理浓度的选择依据课题组前期的研究结果)，照射后继续加入相应浓度的ZnCl2培养细胞至需要时间。

1.2.1检测ZnCl2对UVB照射后的HLECB-3细胞生长的影响

1.2.1.1MTT法取对数生长期的HLEC B-3细胞，按每孔8 000个密度接种于96孔板中培养过夜，观察细胞贴壁生长良好后按上述方法将HLEC B-3细胞分为空白对照组、单纯紫外照射组和ZnCl2实验组，按1.2中处理方法分别处理3组细胞，并继续培养24 h、48 h和72 h后各孔分别加入20 μL(5 g·L-1)MTT，孵育4 h弃去上层液体，加入DMSO后避光震荡10 min，用酶标仪在490 nm波长处进行检测。实验重复3次。

1.2.1.2实时细胞电子分析系统实时细胞电子分析系统(RT-CES)是一种以细胞指数(cell index，CI)值为测量值动态检测细胞增殖的技术[5]。实验过程中CI值与细胞数量呈正比，细胞量越多，CI值越高。首先16×E-plate中各孔分别加入50 μL培养液，进行基线的检测。然后将稀释的细胞悬液(每孔8000个细胞)加入到16×E-plate板孔中，实时监测细胞的生长状况。待细胞CI值增加至0.8～1.2时，按上述空白对照组、单纯紫外照射组和ZnCl2实验组的处理方法进行处理。实时监测HLEC B-3细胞在16×E-plate板孔内的生长状况。

1.2.2DAPI染色将经ZnCl2和UVB处理的空白对照组、单纯紫外照射组和ZnCl2实验组的HLEC B-3细胞继续培养24 h。PBS洗去上层悬浮细胞，用40 g·L-1多聚甲醛室温固定15 min，PBS室温漂洗3次，每次10 min。加入DAPI避光染色20 min，用PBS室温漂洗3次，每次10 min。加入PBS在荧光显微镜下观察，用UV波段激发，观察拍照。

1.2.3实时荧光定量PCR

1.2.3.1总RNA的提取将HLEC B-3细胞按每孔150×103个接种于6孔板中培养过夜。经ZnCl2和 UVB处理后，继续培养2 h消化收集HLEC B-3细胞。各组分别加入1 mL Tripure，再加入200 μL氯仿，4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min。取上层水相置于新的离心管中，加500 μL异丙醇振荡混匀， 4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，弃去上层清液，再加入1 mL体积分数75%乙醇振荡混匀，4 ℃ 8 000 r·min-1离心5 min。弃去上层清液，所得沉淀即为总mRNA。将沉淀室温下干燥7 min后用20 μL无RNA酶的DEPC水溶解。取少量总mRNA用微量紫外分光光度计测定mRNA的纯度和浓度，其余-80 ℃保存备用。

1.2.3.2cDNA的逆转录取600 ng总RNA，加入Oligo(dT)18 1 μL， DEPC水加至12 μL，然后依次加入dNTP混合物(10 mmol·L-1)2 μL，5 × RT Buffer 4 μL，RNA酶抑制剂1 μL，逆转录酶RevertAidTM1 μL，使反应终体积为20 μL。 42 ℃孵育50 min，然后置于70 ℃ 15 min，4 ℃保存备用。

1.2.3.3RT-PCR扩增以cDNA为模板进行聚合酶链反应扩增，引物的序列如下：caspase-12上游引物：5’-GGTCGGCTCTTGCAAGGTAACAT-3’；下游引物：5’-TGGGTCAGTATATTTGGGGTCTCA-3’。GAPDH上游引物：5’-GACCACAGTCCATGACATCACT-3’；下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。 DNA模板1.0 μL，2 × SYBR qPCR混合物10 μL，上下游引物各1 μL，DEPC水7 μL。反应总体积为20 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50个循环周期。

1.2.4ELISA检测Caspase-12蛋白表达的变化将对数生长期的HLEC B-3细胞按每孔150×103个接种于6孔板中培养24 h，给予ZnCl2和UVB处理后继续培养6 h。消化收集细胞，预冷的PBS洗涤2遍，超声波细胞粉碎机粉碎细胞，4 ℃ 8000 r·min-1离心5 min，收集上清，按人Caspase-12 ELISA试剂盒说明书进行操作。用酶标仪测量各样品孔的OD值，计算样品中Caspase-12蛋白的浓度。

2 结果

2.1ZnCl2对UVB照射后HLECB-3细胞活性的影响

2.1.1各组细胞生存率与空白对照组(100%)相比，单纯紫外照射组HLEC B-3细胞的生存率明显降低(P<0.01)；而ZnCl2预处理后再照射UVB的细胞生存率明显高于单纯紫外照射组(P<0.01；见表1)。单纯紫外照射组和ZnCl2实验组不同时间点的细胞生存率比较，差异均有显著统计学意义(F时间=16.367，P=0.000；F浓度=142.162，P=0.001；F交互=11.715，P=0.000)。从表1可以看出：3 mg·L-1ZnCl2对UVB照射后HLEC B-3细胞的保护作用最强。

2.1.2RT-CES动态检测各组细胞生存率RT-CES显示出与MTT一致的实验结果：与空白对照组相比，单纯紫外照射组HLEC B-3细胞的生存率明显降低，而ZnCl2实验组细胞生存率明显高于单纯紫外照射组，且以3 mg·L-1ZnCl2实验组的细胞生存率最高(图1)。

表1 各组HLEC B-3细胞生存率比较Table 1 Survival rate of HLEC B-3 in each group(±s，n=3，rate/%)

Figure 1 Survival rate of HLEC B-3 in each group dynamic detected by RT-CES RT-CES法动态检测各组细胞生存率

2.2DAPI法检测细胞凋亡坏死空白对照组HLEC B-3细胞核形态如图2A所示。与空白对照组相比，ZnCl2实验组正常细胞核型的细胞数量减少，并开始出现核边集、核固缩、核碎裂和凋亡小体(图2B、C、D)。而单纯紫外照射组HLEC B-3细胞的核边集、核固缩、核碎裂和凋亡小体等细胞凋亡坏死表现更为明显(图2E)。

2.3ZnCl2对UVB照射HLECB-3中caspase-12表达的影响实时荧光定量PCR的实验结果见图3。与空白对照组相比，单纯紫外照射组HLEC B-3中caspase-12 mRNA 表达水平增高(94.96±30.15)倍。经ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)预处理2 h后再经UVB照射的ZnCl2实验组HLEC B-3细胞caspase-12 mRNA表达较单纯紫外照射组明显下调，分别为空白对照组的(6.94±4.49)倍、(3.03±1.45)倍、(8.63±4.01)倍，差异均有显著统计学意义(P=0.004、0.002、0.005)。

ELISA法检测经不同浓度ZnCl2和UVB处理后HLEC B-3中Caspase-12蛋白水平：空白对照组细胞中Caspase-12蛋白为(268.31±35.38)pmol·g-1，单纯紫外照射组Caspase-12蛋白表达水平上调，为(1311.98±451.54)pmol·g-1，而经ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)预处理的实验组HLEC B-3中Caspase-12的蛋白水平分别为(297.36±20.73)pmol·g-1、(320.25±86.05)pmol·g-1和(412.07±211.33)pmol·g-1；与单纯紫外照射组相比，差异均有显著统计学意义(均为P=0.000)，但与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

Figure 2 HLEC B-3 stained by DAPI (×200，bar=20 μm).A:Blank control group;B:2 mg·L-1 ZnCl2 +UVB group;C:3 mg·L-1 ZnCl2 +UVB group;D:4 mg·L-1 ZnCl2 +UVB group;E:UVB group DAPI染色的HLEC B-3细胞(×200，Bar=20 μm)。A：空白对照组；B：2 mg·L-1 ZnCl2+UVB实验组；C：3 mg·L-1 ZnCl2+UVB实验组；D：4 mg·L-1 ZnCl2+UVB实验组；E：单纯紫外照射组

Figure 3 Caspase-12 mRNA expression in HLEC B-3 detected by RT-PCR(**P<0.01 vs.normal group;##P<0.01 vs.UVB group) RT-PCR检测HLEC B-3细胞中caspase-12 mRNA的表达结果(与空白对照组相比，**P<0.01；与单纯紫外照射组相比，##P<0.01)

3 讨论

白内障为世界上首要的致盲性眼病，约占致盲眼病的48%[6]，其患病率随年龄增长而明显提高。目前主要以手术方式治疗白内障。随着白内障手术技术的提高和手术方式的改善，白内障手术的安全性、有效性和可预测性已经得到了极大的提高。但白内障手术治疗费用较高，同时手术治疗仍伴随着不可避免的术中和术后并发症。因此以非手术的方式预防和治疗白内障仍是眼科研究的重点问题。大量的研究证实UVB辐射与白内障的发生密切相关[7]。而UVB诱导的晶状体上皮细胞的凋亡是人和动物白内障形成的一个共同细胞学基础[8]。锌是人体非常重要的金属元素，研究表明锌缺乏可以诱导细胞凋亡，而补充锌可以抑制细胞凋亡[9-10]。Duprez等[11]研究表明 ZnCl2可以减少高糖导致的氧化应激，减少大鼠β-细胞的凋亡。UVB照射可诱导氧自由基的产生，进而导致细胞膜、线粒体、基因等正常细胞结构的破坏，最后导致细胞凋亡[12]。因此UVB诱导的细胞损伤本质上也是一种氧化应激。本研究探讨了ZnCl2对UVB照射后的HLEC B-3细胞的作用和其相关机制。DAPI的研究结果表明，适当浓度的ZnCl2可以减少UVB照射诱发的HLEC B-3的细胞核边集、核碎裂的发生，减少凋亡小体的产生。同时MTT和RT-CES的结果也表明，ZnCl2可以减少UVB诱导的HLEC B-3细胞凋亡，对HLEC B-3起到保护作用。

Caspase家族为常见的死亡因子，可参与多种细胞凋亡的调控[13-15]。Park等[16]研究表明UVB照射可以上调caspase-9表达，激活内质网应激凋亡途径，进而导致细胞的凋亡。caspase-12为内质网应激凋亡途径重要的凋亡因子，caspase-12的表达上调可以进一步活化caspase-9的表达，进而活化caspase-3，激活caspase依赖性内质网应激凋亡通路。同时caspase-12的表达上调还可以影响内质网的钙稳态，促使内质网中的非正确折叠蛋白质的积累，从而促进细胞凋亡。本研究RT-PCR和ELISA的研究结果表明，UVB照射可以使HLEC B-3中caspase-12 mRNA和蛋白表达均明显上调，而ZnCl2预处理可以明显抑制UVB照射引发的caspase-12的表达上调，抑制内质网应激凋亡通路，进而减少HLEC B-3的凋亡。

本研究结果表明，适当浓度的ZnCl2对UVB照射后的体外培养HLEC B-3有保护作用，其作用机制可能与ZnCl2抑制UVB照射HLEC B-3中caspase-12上调表达、减少细胞核边集、碎裂和凋亡小体的产生有关，但其详细机制仍需今后进一步探索。

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date：Jan 17，2014

National Natural Science Foundation of China(No： 81072961);Natural Science Foundation of Shandong Province(No：ZR2010HM032)From theShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine(DU Yu-Xiang，TANG Kai，SI Jun-Kang，SHA Fang)，Jinan250014，ShandongProvince，China；EyeInstituteofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，KeyLaboratoryofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineforPreventionandTherapyofOcularDiseasesinUniversitiesofShandong(GUO Da-Dong，BI Hong-Sheng)，Jinan250002，ShandongProvince，China

Protective effects of zinc chloride with appropriate concentrations on human lens epithelial cell damages induced by UVB irradiation

DU Yu-Xiang，GUO Da-Dong，TANG Kai，SI Jun-Kang，SHA Fang，BI Hong-Sheng

zinc ion;lens epithelial cell;ultraviolet B;caspase-12

Objective To investigate the protective effects and its mechanism of zinc chloride (ZnCl2) with appropriate concentrations on human lens epithelial cells (HLEC) B-3 damage induced by ultraviolet B (UVB) irradiations.Methods HLEC B-3 were incubated with ZnCl2(2 mg·L-1，3 mg·L-1，4 mg·L-1)，then cells were exposed to UVB and the survival rate of control group，UVB group and ZnCl2(2 mg·L-1，3 mg·L-1，4 mg·L-1) +UVB groups were detected by MTT assay;The effects of ZnCl2on UVB-induced HLEC B-3 proliferation was dynamic detected using real-time cell electronic sensing (RT-CES) system;Meanwhile，4’，6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining was performed to monitor the protective effects of ZnCl2on UVB-induced HLEC B-3 cell nuclei;Further，the effects of ZnCl2on UVB-induced caspase-12 protein and mRNA expression in HLEC B-3 were tested by both real-time quantitative PCR (RT-PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique.Results MTT assay showed the survival rates of HLEC B-3 in UVB group and ZnCl2(2 mg·L-1，3 mg·L-1，4 mg·L-1) +UVB groups at 24 hours were 34.47%±9.31%，65.91%±12.46%，64.30%±16.24% and 46.36%±6.28%，respectively，which at 48 hours were 8.31%±1.38%，53.82%±11.34%，59.25%±7.58% and 36.57%±8.41%，respectively，which at 72 hours were 6.75%±3.71%，48.29%±10.06%，56.53%±8.47% and 39.57%±8.93%，respectively.RT-CES results suggested that ZnCl2(2 mg·L-1，3 mg·L-1，4 mg·L-1) could decrease UVB-induced HLEC B-3 apoptosis and necrosis.DAPI results showed that ZnCl2could decrease UVB-induced HLEC B-3 cell nuclear condensation and nuclear fragmentation.In the meantime，the expression levels of caspase-12 mRNA and protein were inhibited by ZnCl2in HLEC B-3 under UVB irradiation.Conclusion Appropriate concentrations of ZnCl2can efficiently decrease the expression of caspase-12 under UVB radiation and reduce the UVB-induced impairment on HLEC B-3.ZnCl2plays a protective role in HLEC B-3 under UVB irradiation.

杜宇翔，女，1991年6月出生，山东济宁人，在读硕士研究生。研究方向：白内障及屈光不正。 联系电话：15154142299； E-mail:dyx622@163.com

AboutDUYu-Xiang:Female，born in June，1991.Postgraduate student.Tel:15154142299;E-mail:dyx622@163.com

2014-01-17

国家自然科学基金资助(编号：81072961)；山东省自然科学基金资助(编号：ZR2010HM032)

250014 山东省济南市，山东中医药大学(杜宇翔，唐凯，司俊康，沙芳)；250002 山东省济南市，山东中医药大学眼科研究所、山东省高校中西医结合眼病防治技术重点实验室(郭大东，毕宏生)

毕宏生，E-mail:bhs201307@163.com

杜宇翔,郭大东,唐凯,司俊康,沙芳,毕宏生.氯化锌对紫外线损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用[J].眼科新进展,2014,34(5):405-409.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0112

修回日期：2014-02-20

本文编辑：方红玲

Accepteddate:Feb 20，2014

Responsibleauthor:BI Hong-Sheng，E-mail:bhs201307@163.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(5)：405-409]