蜂王浆主蛋白提取工艺优化及质量分析

于张颖，肖 发，柳丹丹，翟 量，沈立荣

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310058）

蜂王浆是工蜂咽下腺、上颚腺和脑后腺分泌的供蜜蜂幼虫和蜂王食用的浆状物，是决定蜜蜂幼虫成为工蜂还是蜂王的关键因素［1］，对人体具有抗疲劳［2］、抗衰老［3］、免疫调节［4］等保健功能，作为营养保健品、药品、化妆品在国内外广泛应用［5］。最新研究表明，占王浆总蛋白的82%～90%的主蛋白（Major Royal Jelly Proteins，简写MRJPs）是蜂王浆中最重要的活性成分，是代表蜂王浆质量和新鲜度的标志［1］。但目前国内外市场的蜂王浆产品均为蜂王浆原浆或冻干粉加工品，很有必要对MRJPs进行新产品的研究开发。

近年来国内外已先后开展了离心［6］、碱提酸沉［7］、盐提酸沉［7］、柱层析［8－10］等分离 MRJPs 的研究探索，但碱提酸沉、盐提酸沉存在有机溶剂污染、影响蛋白活性、副产物浪费等问题，柱层析则存在工艺复杂、成本偏高的问题，而离心分离具有操作简便、对蛋白活性影响小、王浆酸和多糖等其它活性成分可回收利用的优点。为此，我们开展了MRJPs离心分离和副产物回收利用及产物质量分析研究，为蜂王浆深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜王浆 杭州碧于天保健品有限公司提供;Bradford蛋白定量试剂盒 上海杰瑞生物科技有限公司;中等分子质量蛋白质标准、TMB显色液试剂盒 上海泽衡生物科技有限公司;HRP－羊抗兔抗体 北京庄盟国际生物基因科技有限公;MRJP1多克隆抗体 采用本实验室重组表达的MRJP1免疫大白兔得到［11］。

pH计 赛德瑞斯公司;5804R型冷冻离心机艾本德中国有限公司;CP70MX超速离心机 日本Hitachi公司;752型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;FD－1－50真空冷冻干燥机 南京以马内利仪器设备有限公司;蛋白电泳仪 美国Bio－Rad公司;2300自动凯氏定氮仪 福斯赛诺分析仪器（苏州）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MRJPs提取 称取适量鲜王浆，按一定液料比（2～10mL/g）加入适当浓度的 NaCl溶液（0.3～0.7mol/L），混匀，调节 pH（5～9），4℃充分搅拌一段时间（2～10h）后，4℃、12000r/min 离心 30min，取上清液即为MRJPs溶液，将MRJPs溶液和含糖分、王浆酸的沉淀分别冷冻干燥备用［6］。

用凯氏定氮法测定鲜王浆中蛋白质含量（参考GB 9697－2008）［12］，Bradford 法（BSA 为标准蛋白）测定提取上清液中可溶性蛋白MRJPs含量［13］。

MRJPs提取率（%）=上清液中蛋白质量/所用鲜王浆中蛋白质量×100

1.2.2 MRJPs提取工艺的优化 通过单因素实验考察液料比、pH、抽提时间、离子强度对鲜王浆中MRJPs提取率的影响。液料比选择 2、4、6、8、10mL/g五个水平，pH 选择5、6、7、8、9 五个水平，抽提时间选择2、4、6、8、10h 五个水平，离子强度（NaCl浓度）选择0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol/L 五个水平，以 MRJPs提取率为考察指标。在此基础上选择适当水平进行了四因素三水平正交实验（表1），以优化MRJPs的提取工艺。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal design

1.2.3 SDS－PAGE电泳分析 参考《分子克隆·第三版》［14］，对提取所得蛋白进行 SDS－PAGE 电泳，采用12%分离胶，考马斯亮蓝法染色，对结果拍照分析。

1.2.4 MRJP1提取分离 参考Salazar－Olivo L A等人的方法［6］改进:称取适量鲜王浆，用等质量超纯水稀释混匀，充分抽提6h;混合液在245000×g、4℃条件下离心5h，出现分层现象后，将中间层取出，用2倍质量超纯水将中间层溶解，室温下抽提1h，混匀;将该液在30000×g、6℃下离心30min，取上清;上清液在245000×g、6℃下离心5h，取沉淀，此沉淀即为MRJP1蛋白，－20℃保存。

1.2.5 ELISA法检测MRJPs纯度 我们前期研究已证实，MRJP1与MRJPs家族其它成员具有很高的同源性，MRJP1多克隆抗体可与MRJPs家族其它蛋白产生交叉反应［15］，因此本实验中以大肠杆菌中重组表达的MRJP1制备的多克隆抗体为一抗，以MRJP1为标准蛋白，采用间接ELISA法测定提取产物冻干粉中MRJPs蛋白含量。

1.2.5.1 标准曲线的建立 参考文献［16］，将MRJP1溶于 CBS缓冲液（0.05mol/L，pH=9.6）中，配成10μg/mL的溶液，倍比稀释后加样于96孔板中，4℃包被过夜。PBST（0.05%）洗涤，5%脱脂牛奶37℃封闭1.5h。PBST洗涤，MRJPs全蛋白多克隆抗体（一抗，1∶5000稀释）37℃孵育1h。PBST洗涤，HRP标记的羊抗兔抗体（二抗，1∶5000稀释）37℃孵育0.5h。PBST洗涤，TMB显色液室温反应15min后加入2mmol/L H2SO4终止显色反应。立即于酶联免疫检测仪上测定450nm及630nm处吸光值。以OD450～OD630为纵坐标，MRJP1浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.5.2 MRJPs定量分析 同法测定最佳提取条件下MRJPs提取液冻干粉（配成15μg/mL溶液）的MRJPs含量。

1.2.6 MRJPs冻干粉中水分和王浆酸测定 参照GB 9697－2008［12］测定 MRJPs冻干粉中水分和王浆酸的含量。

1.2.7 鲜王浆及MRJPs提取副产物中王浆酸和总糖测定 取鲜王浆及MRJPs提取副产物沉淀的冻干物，参照 GB 9697－2008［12］，采用分光光度法测定总糖含量，采用液相色谱法测定王浆酸含量，二者回收率的计算方法为:

王浆酸回收率（%）=沉淀中王浆酸质量/所用鲜王浆中王浆酸质量×100

总糖回收率（%）=沉淀中总糖质量/所用鲜王浆中总糖质量×100

1.3 数据统计及分析

所有实验均作三组平行，所得数据用DPS软件进行统计分析，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 液料比对MRJPs提取率的影响 在pH=7，抽提时间6h，离子强度0.5mol/L条件下，由图1可知，液料比在2～10mL/g范围内，液料比越高，MRJPs提取率越高。其中，在2～4mL/g及8～10mL/g范围内，MRJPs提取率随液料比增高而增长较快;在4～8mL/g范围内，MRJPs提取率随液料比增高而增长缓慢。考虑到生产过程中加水过多会带来额外的脱水成本，选择4、6、8mL/g作为正交实验的三个水平。

2.1.2 pH对MRJPs提取率的影响 由图2可知，在液料比6mL/g，抽提时间6h，离子强度0.5mol/L条件下，当pH在5～6范围内时，MRJPs提取率随pH增高而快速增长;当pH在6～7范围内时，MRJPs提取率随pH增高而较快增长;当pH在7～8范围内时，MRJPs提取率随pH增高而略有增高;当pH在8～9范围内时，MRJPs提取率随pH增高而缓慢下降。根据提取率大小选择pH7、8、9进行正交实验。

图1 液料比对MRJPs提取率的影响Fig.1 Effect of the ratio of solution to sample on MRJPs extraction rate

图2 pH对MRJPs提取率的影响Fig.2 Effects of pH values on MRJPs extraction rate

2.1.3 抽提时间对MRJPs提取率的影响 在液料比6mL/g，pH=7，离子强度0.5mol/L条件下，抽提时间在2～10h范围内，MRJPs提取率随抽提时间延长而提高。在2～4h范围内，MRJPs提取率随抽提时间延长而快速提高;在4～10h范围内，MRJPs提取率随抽提时间延长而缓慢提高。其结果见图3。综合考虑生产效率的影响，选用4、6、8h三个水平进行正交实验。

图3 抽提时间对MRJPs提取率的影响Fig.3 Effect of extracting time on MRJPs extraction rate

2.1.4 离子强度对MRJPs提取率的影响 由图4可见，在液料比6mL/g，pH=7，抽提时间6h条件下，离子强度为0.3～0.6mol/L时，随着离子强度的增大，MRJPs提取率随之提高;离子强度为0.6～0.7mol/L时，MRJPs提取率随离子强度的增大而降低。综合考虑提取率及脱盐带来的成本，选择离子强度0.3、0.4、0.5mol/L进行正交实验。

2.2 正交实验

图4 离子强度对MRJPs提取率的影响Fig.4 Effect of ionic strength on MRJPs extraction rate

以MRJPs提取率为指标进行实验并对结果进行极差和方差分析。由表2和表3可知，影响MRJPs提取率的因素依次为:离子强度＞pH＞抽提时间＞液料比，但影响均不显著（p＞0.05）。由表2可知，最佳条件组合为A3B2C3D3，即液料比8mL/g，pH8，抽提时间8h，离子强度0.5mol/L。按此优化工艺作进一步验证，结果MRJPs提取率达81.14%。

表2 正交实验结果Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

表3 方差分析结果Table 3 Result of variance analysis

2.3 SDS－PAGE电泳检测

根据MRJPs蛋白SDS－PAGE电泳图（图5）中的蛋白标准估计，MRJPs标蛋白条带主要分布范围在42.1～97.4ku，其中以分子量为57ku的条带最明显，与Kamakura等报道的MRJP1分子量一致［2］。同时，MRJP1的纯化产物也显示为分子量为57ku单一蛋白条带，也符合已报道的 MRJP1蛋白特征［2］，说明MRJP1提取得到了单一蛋白。

2.4 MRJPs纯度分析

图5 MRJPs和MRJP1 SDS－PAGE电泳图Fig.5 SDS－PAGE analysis of MRJPs and MRJP1泳道M:蛋白质Marker。

MRJP1标准曲线如图6，得到MRJP1与吸光度间的回归方程:y=0.1100x+0.1239（R2=0.998，式中y为吸光度，x为MRJPs含量），将所测MRJPs冻干粉的吸光度（OD450－OD630=1.306±0.110）代入该式，换算得含MRJPs冻干粉纯度为71.7%。

图6 MRJP1标准曲线Fig.6 Standard curve of MRJP1

2.5 MRJPs冻干粉中水分和王浆酸含量分析

按照GB 9697－2008测得MRJPs提取物冻干粉含水分0.005%，王浆酸0.55%。

2.6 MRJPs提取副产物中王浆酸及总糖分析

鲜王浆及最佳条件下提取MRJPs产生的沉淀冻干物中王浆酸及总糖含量见表5。经换算得副产物质量为原料的2.68%，其中王浆酸和总糖回收率分别为2.91%和1.26%。

表4 鲜王浆和副产物中王浆酸及总糖分析结果Table 4 Analysis of 10－HDA and total sugar in fresh royal jelly and by－product

3 结论与讨论

蓝瑞阳等［7］报道的蜂王浆蛋白的盐提酸沉法收率为83.62%，碱提酸沉法收率为75.17%，但该报道没有做纯度测定。本研究通过正交实验，得到了离心提取王浆主蛋白MRJPs的最佳工艺:液料比8mL/g，pH8，抽提8h，离子强度0.5mol/L。在此条件下，MRJPs提取率达到81.14%，产物纯度达到71.7%。同时实现了副产物王浆酸和总糖的回收，使蜂王浆活性产物得到充分利用。此外，采用自制重组表达MRJP1多克隆抗体，通过ELISA法检测了所提取MRJPs的纯度，为蜂王浆深加工和质量控制提供了科学依据。

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