白洋淀乌鳢线粒体D－Loop区序列遗传多样性分析

董新培，穆淑梅，周楠，康现江，白俊杰

（1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.中国水产科学研究院 珠江水产研究所，广东 广州 510380）

白洋淀地处京、津、保三市之间，是华北平原上的最大湖泊，素有“华北明珠”之誉，鱼类资源丰富，经济鱼类以鲤科为主，其次是鳢科、鲇科、鳅科和鲿科等［1］.近十几年来，由于水资源匮乏和人类大规模生产活动的影响，严重破坏了白洋淀的生态平衡，从而导致白洋淀鱼类在数量和种类上都发生了很大变化［2］.乌鳢（Channa argu）俗称黑鱼，属鲈形目（Perciformes）、鳢科（Channidae）、鳢属，是生活在河川、湖泊中的一种凶猛的肉食性鱼类，分布较广，遗传资源丰富，最初在渔业生产中被视为养殖的害鱼而被捕杀和清除［3－4］，因其肉质细嫩、少刺、味道鲜美、营养丰富及适应性强等特点，目前已成为我国重要淡水经济鱼类［5］.乌鳢种群作为白洋淀淀内重要的经济鱼类，对维持淀内稳定的生态系统和生物遗传多样性具有重要意义.

线粒体DNA 为母系遗传，基因组结构简单，进化的速度是核基因组的5～10倍，且不发生重组现象，线粒体DNA 遗传标记在鱼类进化生物学和群体遗传学研究方面获得了很多重要成果［6－8］.D－Loop区是线粒体上一段非编码序列，位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间，是脊椎动物线粒体序列长度变异最大的区域，具有较高的突变率，在物种的进化过程中是线粒体基因组进化最快的部分，一般用于种内和种群间的遗传进化分析［7－9］.随着PCR 技术的快速发展，PCR 测序技术更多地应用于遗传多样性的研究，因其具有反应快，稳定性高等特点，较RFLP具有优越性，深受广大研究者的青睐［10－11］.2010年温晓曦等［12］分离和筛选了乌鳢微卫星序列，同年刘改艳等［13］利用SSR－BSA 技术对乌鳢性别差异标记进行了初步筛选，刘苏等［14］利用AFLP分子标记技术对斑鳢、乌鳢及其杂交种进行了遗传差异的分析.而有关乌鳢线粒体D－Loop区的研究并未报道.本研究利用线粒体D－Loop区分析河北省白洋淀养殖与野生乌鳢群体中的线粒体D－Loop区的特征及其差异，分析该区养殖与野生乌鳢群体的遗传多样性，揭示乌鳢种群的遗传特征，为白洋淀乌鳢天然和养殖资源调查和遗传多样性分析提供基础资料.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用野生乌鳢样本30尾采自河北省白洋淀淀区内；养殖样本32尾购于河北省安新县城水产市场，养殖群体亲本为外地引进的养殖鱼苗.活鱼带回实验室，取背部肌肉组织，置于离心管内，冻存于－80 ℃保存备用.

1.2 乌鳢总DNA的提取

每尾乌鳢取肌肉样品20～30mg剪碎.采用蛋白酶K 进行消化，按常规酚－氯仿抽提法提取总DNA，得到的DNA 用双蒸水充分溶解，并通过吸光值检测和琼脂糖凝胶电泳检测来评价DNA 样品的品质，存于－20 ℃保存备用.

1.3 乌鳢线粒体控制区PCR 扩增及序列测定

扩增乌鳢线粒体D－Loop区的引物参照黄志坚等［15］发表的淡水鱼通用引物，送上海生工生物工程有限公司进行合成，引物序列为

MitD1－F：5′－CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA－3′；

MitD1－R：5′－GGTGCGGRKACTTGCATGTRTAA－3′.

PCR 反应体系为50μL，其中含有10×Buffer 5μL、dNTP 1μL、2种引物各2μL、Taq DNA 聚合酶1μL、模板DNA 2μL、加ddH2O 至50μL.PCR 扩增程序如下：94 ℃预变性2min，33个循环，每个循环包括94℃变性30s，54℃退火50s，72℃延伸3min，最后72℃延伸10min，4℃保存.用10g／L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，送往上海生工生物工程有限公司进行双向测序，使用PCR 扩增引物作为测序引物.

1.4 数据分析

使用Clustal X 1.81比对测序结果，辅以人工校对.利用MEGA4.1软件统计序列的碱基含量及遗传距离；通过DnaSP（version4.1）软件统计单倍型（h）、单倍型多样性（Hd）、核苷酸多样性（Pi）、平均核苷酸差异数（k），并计算群体间分化指数（Fst）和基因流（Nm）.利用邻接法（Neighbor－Joining，NJ）基于Kimura双参数（Kimura 2－parameter，K2P）模型构建乌鳢群体系统发生树，进化树各分支的自举置信度水平由自举法（Bootstrap value）估计，自引导次数为1 000.

2 结果

2.1 乌鳢种群线粒体DNA D－Loop区序列特征

在GenBank数据库中检索出乌鳢线粒体DNA 全序列（GenBank登录号GU937112），与扩增获得的序列比对，找到乌鳢线粒体D－Loop区的起止位点，确定乌鳢线粒体D－Loop区序列全长为906～908bp，长度变异较小.T，C，A，G 碱 基 平 均 含 量 分 别 为28.14%，22.36%，34.38%，15.12%，其 中A＋T 的 含 量（62.52%）高于G＋C含量（37.48%），具有明显的碱基组成偏向性.经分析，养殖和野生乌鳢群体的线粒体D－Loop区的碱基组成呈该分布特点（表1）.

表1 乌鳢线粒体D－Loop区碱基组成Tab.1 Nucleotide compositions of mtDNA D－Loop in Channa argu

2.2 乌鳢种群遗传多样性分析

在62个乌鳢样本线粒体D－Loop 区序列中，共检测到112 个变异位点，占全部序列的12.3%；其中106个简约信息位点，占全部序列的11.67%.其中转换位点63 个，占总变异位点的56.25%，颠换位点35个，占总变异位点的31.25%，碱基转换／颠换比值（R）为1.71.表2所示为养殖和野生乌鳢群体基于DLoop序列分析得到的遗传多样性参数，由表2可以看出，野生乌鳢群体的遗传多样性参数均低于养殖群体的.利用Kimura双参数法计算2大群体内部以及群体间的遗传距离，结果表明：养殖群体的个体间遗传距离为0～0.02，平均遗传距离为0.01；野生群体的个体间遗传距离为0～0.01，平均遗传距离为0.005；而2个群体间的个体间遗传距离为0～0.12，平均遗传距离为0.06，相对于单个群体，群体间的遗传距离较大.

表2 乌鳢种群线粒体D－Loop区序列的遗传多样性参数Tab.2 Genetic diversity parameters of mtDNA D－Loop sequence of Channa argu population

基于线粒体D－Loop区序列计算养殖和野生乌鳢群体间分化指数Fst为0.943 44，表明有94%的遗传变异存在群体间，揭示了2群体间有较远的亲缘关系；基因流Nm为0.014 99，远远小于1，说明2群体间具有较大的遗传分化.

2.3 乌鳢群体亲缘关系树

以NJ法构建系统发育树（图1）显示，野生和养殖乌鳢群体的个体各自聚集为独立的分支，遗传距离近的个体聚成一簇，且无交叉分支，即2群体间表现为明显的分化.

3 讨论

3.1 乌鳢线粒体D－Loop区序列碱基组成及序列变异

所测定的62尾乌鳢线粒体D－Loop区序列中，T（28.14%），C（22.36%），A（34.38%），G（15.12%）含量呈不均一性分布，且A＋T 的含量（62.52%）显著高于G＋C 的含量（37.48%），这与其他鱼类D－Loop区核苷酸组成特点相似［16］.线粒体D－Loop 区发生碱基转换的频率（56.25%）显著高于颠换的频率（31.25%），这 与 同 目 的 大 黄 鱼（Pseudosciaena crocea）［17］和鲈鱼（Trachidermus fasciatus）［18］线粒体D－Loop区发生转换频率高于颠换的规律相符，具有较高的碱基替换率.

图1 基于线粒体DNA D－Loop区序列构建的乌鳢群体间的NJ树Fig.1 NJ tree based on the mtDNA D－Loop sequence of Channa argu populations

3.2 乌鳢线粒体D－Loop区遗传多样性的分析

核苷酸多样性（Pi）和平均遗传距离是衡量一个群体的2 个重要指标［19］.从乌鳢种群内的Pi值来看，野生群体的核苷酸多样性Pi（0.001 43）比养殖群体的Pi（0.009 64）低，与银鲳（Pampus argenteus）［20］（野 生 群 体0.007 和 养 殖 群 体0.004）和斜带髭鲷（Hapalogenys nitens）［21］（野生群体0.022 02和养殖群体0.022 77）相较，养殖和野生乌鳢群体的遗传多样性均为较低水平，而2个群体间的核苷酸多样性却明显高于前两者，主要表现为野生和养殖群体间核苷酸差异较大，说明养殖和野生群体间存在较大的遗传差异.遗传距离多用来分析不同群体间的遗传分化程度和群体内的遗传多样性［22］.养殖群体个体间的平均遗传距离为0.01，野生群体内个体间的平均遗传距离为0.005，乌鳢种群内个体间的平均遗传距离为0.06，波动范围较群体内大，表现为群体间多态性较高.由此看出，乌鳢群体内的差异很小，而种群间的序列差异很大.乌鳢2 个群体的Fst为0.943 44，Nm为0.014 99，表明养殖群体和野生群体间具有一定的遗传分化，且基因交流比较匮乏.

综上结果显示，野生和养殖乌鳢群体的遗传多样性均为较低水平，且野生乌鳢群体的遗传多样性较养殖群体低，这个结果与以往野生群体遗传多样性较高不同.这可能是因为养殖群体在繁育过程中引入不同地点的乌鳢亲本，一定程度上丰富了养殖群体的遗传多样性；野生群体受自然因素和人为因素的影响导致遗传多样性降低.自然因素：白洋淀呈浅碟形的湖底，虽水域面积很大，容水量却很小，鱼群在小范围内生存活动，生存环境相对稳定，与外界遗传交流相对较少，因而导致野生群体在进化过程中表现出趋同性［23］.人为因素：上游修建了大量的水利工程设施，致使白洋淀的蓄水量逐年下降，造成了淀内鱼的种量减少，过度的捕捞也使得淀区自然鱼类生态环境遭到破坏，致使一些经济鱼类资源的衰退［2，24］.近几年来开展了引水入淀工程，从研究结果分析乌鳢野生群体遗传多样性较低，种群相对比较稳定，推测无淀外的乌鳢进入白洋淀或外来的数量不足以改变白洋淀群体的遗传多样性.

3.3 乌鳢群体系统发育分析

在此研究中所测乌鳢群体的62个样本分属于9种单倍型，养殖与野生群体内的单倍型数分别为4与5，每个群体内的单倍型都是其独有的单倍型，养殖群体与野生群体间无共享单倍型.NJ系统树也显示2个群体各自聚集为独立的分支.由于线粒体DNA 为母系遗传，一般不发生重组，表明2个群体间具有一定的遗传分化，为2个母系起源.

综上所述白洋淀乌鳢种群在进化过程中单倍型多样性和遗传多样性均比较低，这表明白洋淀乌鳢群体适应环境的能力已经减弱，因此有必要开展白洋淀乌鳢群体保护工作，根据白洋淀当地的环境特点，制定科学有效的保护措施，加强对野生和养殖乌鳢群体的保护.本研究仅仅是分析了白洋淀区域乌鳢资源遗传多样性，不能全面地反映不同地理群体乌鳢的遗传多样性水平与群体分化状态.今后将继续应用线粒体D－loop基因分析不同地区乌鳢群体的遗传背景，以期全面揭示乌鳢资源的遗传多样性水平.

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