维吾尔药指甲花和凤仙花的定性鉴别研究＊

刘 涵，王金芳，高增平，史家文，石 钺

(1. 北京中医药大学中药学院，北京 100102; 2. 中国医学科学院·北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)

指甲花Lawsonia inermis L. 是维吾尔医常用药材之一，尽管 很常用，但实际上新疆并不出产，从古至今维吾尔医用指甲花均由国外进口。近几十年来，由于维吾尔医药的发展，进口指甲花已无法满足维吾尔医临床应用和化妆品生产的需求，加之维吾尔族的语言不通、交通不便、信息不畅，不了解我国南方地区也有指甲花的野生和栽培资源，所以误认为新疆地区栽培的亦能染指甲的凤仙花Impatiens balsamina L. 即是指甲花[1-4]。同时，尽管指甲花和凤仙花的原植物科属不同，前者属于千屈菜科，后者属于凤仙花科，但两者的叶均可染色，其着色成分也很相似，且植物叶粉碎后难以用肉眼加以区分，这就给临床应用和市场流通造成很大困难。国外学者曾采用高效液相色谱(HPLC)法或薄层色谱(TLC)法对指甲花的指纹图谱进行过研究[5-7]，但对于指甲花和凤仙花的定性鉴别，目前尚未见报道。笔者采用TLC 法和HPLC 法对指甲花和凤仙花的指纹图谱进行比较，建立了两者的特征定性鉴别方法，为指甲花和凤仙花的正确应用提供试验依据。

1 仪器与试药

UVⅢ型暗箱式三用紫外分析仪(北京恒诚基业科贸有限公司);Water2695 型高效液相色谱仪(Waters2996 二极管阵列检测器);AB135-S 型十万分之一分析天平(瑞士梅特勒公司);SB-5200D 型超声波清洗机(中国宁波);TG16 -Ⅱ型高速离心机(中国长沙);薄层层析用硅胶G(青岛海洋化工厂)。甲醇和三氟醋酸(TFA)为色谱纯;水为娃哈哈纯净水;其他化学试剂均为分析纯。指甲花叶分别自采和购买于福建、海南、云南、广东、印度和巴基斯坦，凤仙花叶自采于新疆和北京，原植物由中国医学科学院药用植物研究所石钺研究员鉴定。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

称取0.5 g 样品的干燥粉，精密称定0.1 mg，过40 目筛，置50 mL 具塞刻度离心管中，精密加入20 mL甲醇，称定质量，超声处理30 min(控制超声温度在30 ℃以下)，置室温，称定质量，用甲醇补足减失的质量，以5 000 r/min的速率离心5 min，取上清液，即得供试品溶液。精密吸取上述溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，展开前先预饱和30 min，用氯仿-甲醇(12 ∶1)为展开剂展开，展距在8 cm 以上，取出，晾干，置365 nm波长紫外光灯下检识。结果6 种不同产地的指甲花均可检出Rf 为0.45 和0.51 的红色荧光斑点，凤仙花未检出;凤仙花可检出Rf=0.74 的紫色荧光斑点，指甲花未检出(见图1)。试验结果表明，指甲花和凤仙花的薄层色谱有显著性差异。

图1 药材薄色谱图

2.2 HPLC 鉴别

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil® C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:A 为甲醇，B 为0.05%TFA 水溶液，按表1 方法进行梯度洗脱;流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μL;在线检测波长:245 nm。

2.2.2 供试品溶液制备

取2.1 项下供试品溶液，用0.45 μm 滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

精密度试验:取同一指甲花供试品溶液，按拟订色谱条件连续进样6 次，测定指纹图谱，考察各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积。结果显示，各共有指纹峰相对保留时间的RSD 均小于2% (0.030% ～1.400% )，各 峰 峰 面 积 的 RSD 均 小 于3%(0.371% ～2.435%)，符合相关规定，表明其精密度良好。

表1 甲醇-0.05%TFA 水二元梯度表

重复性试验:精密称取同一指甲花样品，平行操作6 份，每份约0.5 g，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液并测定指纹图谱，考察各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积。结果显示，各共有指纹峰相对保留时间的RSD 均小于1%(0.040% ～0.263%)，各峰峰面积的RSD 均小于2%(0.320% ～1.500%)，符合相关规定，表明其重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h 时按拟订色谱条件进样测定指纹图谱。结果显示，各共有指纹峰相对保留时间的RSD 均小于2%(0.011% ～1.342%)，各峰峰面积的RSD 均小于5%(0.359% ～4.809%)，表明指甲花供试品溶液在8 h 内基本稳定。但随着时间的增加，某些峰的峰面积逐渐减小，影响测定，故指甲花供试品溶液最好现用现配，且应在8 h 内进行测定。

2.2.4 结果

按2.2.2 项下方法制备指甲花和凤仙花的供试品溶液，在拟订色谱条件下进样。测定各批供试品溶液的指纹图谱，记录时间为105 min。色谱图见图2 至图5。

图2 2 批凤仙花药材指纹图谱的叠加图

图3 6 批指甲花药材指纹图谱的叠加图

图4 2 批凤仙花药材和6 批指甲花药材指纹图谱的叠加图

图5 指甲花药材的特征色谱峰

因凤仙花种类和分布过于广泛，本研究中仅通过对北京和新疆两个产地差别较大的凤仙花进行HPLC 鉴别研究，结果见图2。可见，不同产地的凤仙花化学成分可能无显著性差异。因目前指甲花在国内种植很少，故仅能对已知分布在福建、海南、云南、广东等地的栽培指甲花和市场中流通最广的印度、巴基斯坦指甲花进行分析研究，结果见图3。可见，不同产地的指甲花化学成分虽有一定差异，但仍具有明显的共有特征。通过对凤仙花和指甲花HPLC 指纹图谱的比较(见图4)，发现凤仙花和指甲花的化学成分确实存在相似性，但各自又有其明显的特异性。凤仙花中所含极性较大的化学成分含量明显低于指甲花，通过指甲花的共有峰与凤仙花的比较，共确定了8 个指甲花的特征性色谱峰(见图5)，其保留时间分别为t1=2.797，t2=8.633，t3=22.606，t4=35.962，t5=52.996，t6=57.233，t7=58.569，t8=71.137。

3 讨论

指甲花与凤仙花均有染色作用，且植物叶粉碎后难以用肉眼加以区分，但实际上是两种不同科属的植物，应严格区别，不能混用。本研究中建立了指甲花和凤仙花的TLC 和HPLC 鉴别方法，结果表明，所建立的TLC 法可初步鉴别指甲花和凤仙花;HPLC法鉴别表明，不同产地的凤仙花化学成分可能差别不大，不同产地的指甲花虽存在一定的差异性，但仍具有明显的共有特征。利用HPLC 法鉴别指甲花和凤仙花时，可根据其极性较大的化学成分的含量结合是否具有指甲花的特征色谱峰加以判断。本研究方法的建立，也为维吾尔药指甲花的质量控制提供了鉴别依据。

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