莲藕愈伤组织诱导及组织学观察

李佳+赵文龙+周长艳+王震宇

摘要：以莲藕（Nelumba nucifera）的顶芽和侧芽为外植体，接种于不同外源激素配比的MS培养基上进行愈伤组织诱导。结果表明，愈伤组织诱导的最佳培养基为MS基本培养基+0.5 mg/L 6-BA+4.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA+0.20% Gelrite，诱导率在20%以上，且愈伤组织状态良好，颜色淡黄色至黄褐色，生长量较大。其中，2，4-D在莲藕愈伤组织诱导中起重要作用。从组织学切片的显微观察结果分析，单宁类物质可能是导致莲藕愈伤组织诱导过程中极易褐化的重要因素之一。以Gelrite代替琼脂粉作为固化剂，可明显改善外植体的褐化现象。

关键词：莲藕（Nelumba nucifera）；愈伤组织；单宁；褐化

中图分类号：S645.1；Q813.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0701-03

莲藕（Nelumba nucifera）为睡莲科（Nymphaeaceae）莲属（Nelumbo）多年生大型水生草本植物，是双子叶植物的较低级种，原产于中国和印度，在中国栽培历史悠久[1]。在自然选择和人工选择中，产生很多变异，因而种质资源丰富。莲藕营养丰富，含淀粉、蛋白质、糖、维生素等多种营养成分，营养价值较高[2]。然而，由于莲藕主要以块茎进行无性繁殖，多年反复栽培后，种质容易退化。此外，以常规方法进行莲藕的繁育，繁殖率低、用种量大、生产成本较高，且病毒病、褐斑病、腐败病等病害易发生，给莲藕的制种和品质改良带来了的困难，使其产量和质量受到影响[3]。利用组织培养技术进行莲藕的培养可提高其无性繁殖率，并保持良好的遗传稳定性[4]。本试验以莲藕顶芽及侧芽为材料进行愈伤组织诱导，并对其发生过程进行了组织学观察，对愈伤组织的发生机理进行了初步研究，为莲藕的种质保存及品种改良奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试莲藕品种为鄂莲五号“3735”（品种号），由湖北省武汉市东西湖区吴家山西湖大队提供。于2010年3至4月栽种期取藕头饱满、顶芽完整的种藕为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织诱导

1）材料处理。选取莲藕顶芽与侧芽，将其外部叶片剥去，在自来水下冲洗干净，然后在无菌条件下用75%的乙醇消毒30 s，随即放入0.1%升汞溶液中处理15 min，用无菌水漂洗4次，横切成0.3 ～ 0.5 cm3的外植体，接种到培养基上进行培养。

2）愈伤组织诱导培养基。以MS为基本培养基，pH调至5.8～6.0，蔗糖3%，添加不同浓度水平的6-BA、NAA、2，4-D、琼脂粉或Gelrite、活性炭，组成愈伤组织诱导培养基，以这5个因素，每因素4个水平进行L16（45）正交试验，试验因素和水平见表1。

3）培养条件。温度为（25±2） ℃，避光培养。

1.2.2 愈伤组织发生过程的组织学观察 接种后，每隔10 d取具有代表性的样品组织块，FAA固定液固定24 h，70%乙醇∶冰醋酸为3∶1（V/V）的溶液中保存。材料收集齐后，用70%乙醇将酸洗净，经乙醇/二甲苯系列脱水后，石蜡包埋，石蜡切片机切片，厚度10 μm，切片脱蜡复水后采用苏木精染色法染色，乙醇系列脱水后二甲苯透明，中性树胶永久封片[5]。采用光学显微镜镜检拍照。

2 结果与分析

2.1 不同培养基配比对莲藕愈伤组织诱导的影响

将莲藕顶芽和侧芽横切成0.3～0.5 cm3的外植体，按照表1所示的正交试验，接种在不同浓度配比的愈伤组织培养基中诱导，10 d左右可见外植体组织膨大，30 d左右开始形成愈伤组织（图1），50 d左右大量愈伤组织形成，此时若不及时更换培养基，组织则极易褐化死亡。将50 d时愈伤组织的诱导情况进行统计分析，结果如表2所示。结果表明，不同成分配比的培养基对莲藕茎尖的愈伤组织诱导有较大的影响。

正交试验结果（表2）表明，从愈伤组织诱导率的结果来看，13号试验的效果最好，达到36.67%，其次为7号试验，结果为33.33%。通过比较极差R值的大小，对愈伤组织诱导率的影响由大到小的因素为2，4-D、固化剂、6-BA、活性炭、NAA。表明2，4-D的浓度水平的变化对莲藕愈伤组织的诱导起主导作用，其极差可达25.000；且随着2，4-D浓度的增加，愈伤组织诱导率也明显增加。其次为固化剂的影响，添加Gelrite比添加琼脂粉对愈伤组织的诱导更有利，然而并不是浓度越高效果越好，其最佳浓度为0.2%。6-BA的添加也对愈伤组织的诱导起到明显作用，其R值为8.335。活性炭和NAA对愈伤组织诱导率的影响不大，其极差分别为7.500和5.829。

愈伤组织诱导50 d左右的情况见表2。当2，4-D浓度增高时，虽然愈伤组织诱导率明显增加，但形态上逐渐出现大量结节状愈伤，此类愈伤组织很难分化成苗，因此，选择2.0或4.0 mg/L的2，4-D对于愈伤组织的诱导更为有利。此外，若2，4-D浓度较高并同时添加较高浓度6-BA时，则伴有少量硬块出现，所以6-BA的浓度也不宜过高。NAA对愈伤组织诱导率的影响不大，然而添加一定量的NAA有助于愈伤组织的诱导，当添加较低浓度的NAA时，愈伤组织的生长量有所增加，颜色由淡黄色变为黄色。固化剂对愈伤组织的诱导同样有较大的影响。当以琼脂粉为固化剂时，愈伤组织普遍呈现暗黄色，易褐化，生长量也较少；若同时添加活性炭，褐化现象有所改善；当以Gelrite为固化剂时，愈伤组织颜色变浅，褐化现象明显减少，生长量也普遍增加。

综合愈伤组织诱导率和诱导状态的结果分析，得到诱导莲藕愈伤组织的最佳培养基配方为：MS基本培养基+0.5 mg/L 6-BA+4.0 mg/L 2，4-D+ 0.1 mg/L NAA+0.20% Gelrite。采用该培养基配方进行验证试验，愈伤组织诱导情况较为理想，诱导率普遍在20%以上，且愈伤组织状态良好，颜色为淡黄色至黄褐色，生长量较大。

2.2 莲藕愈伤组织诱导过程的组织学观察

采用正交试验得到的最佳培养基配方诱导莲藕愈伤组织，外植体接种后，每隔10 d取样1次，制片拍照，结果见图2。培养10 d左右，可见细胞核染色加深，核质比增大，细胞开始活跃分裂（图2a）；培养30 d左右，细胞内容物染色加深，细胞质浓厚，细胞分裂旺盛，愈伤组织形成，并出现少量单宁细胞（图2b）；培养50 d左右，可见大量细碎的染色较深的细胞，内部出现大量无规则的维管束（图2c），此时应及时转入新鲜培养基，若不及时转接，继续培养到60 d，则结构变得疏松，且出现大量染色很深的单宁细胞（图2d），此时，愈伤组织极易褐化死亡。

3 讨论

在莲藕组织培养过程中，污染比较严重，可能是莲藕本身存在很多空隙，其中的微生物在消毒灭菌过程中不容易被消灭，因此造成组织培养过程中较为严重的污染情况。可以采取一定的方法减少类似情况发生，比如取材要新鲜，切取顶芽或侧芽时尽量不要损伤芽体，以免暴露内部的空隙。

此外，褐化问题一直是莲藕组织培养过程中普遍存在的现象。分析原因，与莲藕中多酚氧化酶（PPO）活性较高有关[6，7]。切取的外植体在接触氧气后，切口处多酚类物质在PPO的作用下，氧化成醌，导致莲藕褐化，积累较多时，对外植体产生毒害[8]。从组织切片观察结果看，单宁类物质随着培养的时间加长而增加，而单宁是多酚高聚化合物。朱玉球等[9]在研究山核桃愈伤组织诱导过程中发现随着单宁物质含量的减少，愈伤组织形成部位向切口上移，说明单宁的存在可抑制愈伤组织的发生，本试验结果显示，培养时间越长，单宁含量越高，组织越容易褐化，愈伤组织的产生越少，因此分析单宁是导致莲藕极易褐化的主要原因之一。本试验中采取了多种方法抑制莲藕外植体的褐化。其中比较有效的方法包括及时继代，减少培养时间，可一定程度上减缓单宁物质的影响；另外，在培养基中添加一定量的活性炭，可吸附部分醌类，有效控制褐化现象，然而活性炭同时也吸附了其他的营养物质，对愈伤组织的生长和增殖有一定影响。因此，在培养初期采用活性炭，到后期组织情况稳定后，可不必再添加；此外，采用Gelrite替代琼脂作为固化剂可明显改善褐化情况，分析原因，可能是由于Gelrite成分更为纯净，在固化效果相同的情况下，用量少，一般仅为琼脂用量的1/3，甚至更少。因此，Gelrite固化剂渗透性强，使产生的醌更快扩散。

此外，莲藕的愈伤组织诱导率较低，一般最高仅为30%左右，相应的类似报道也不多见，刁英等[10]报道的莲藕愈伤诱导结果表明，最佳培养基为MS基本培养基+0.5 mg/L 6-BA+5.0 mg/L 2，4-D，最高诱导率可达32%，诱导率同样较低。因此，要达到实际生产的要求，还需要进一步研究更加适合的培养方案。

参看文献：

[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴（第一册）[M].北京：科学出版社，1994.646.

[2] 张建福，王 锋.莲藕的组织培养现状与展望[J].上海农业科技，2000（4）：10.

[3] 陈丽萍，周可明，张志友.莲藕组织培养研究进展[J].现代农业科技，2008（20）：15-16.

[4] 刁 英，韩延闯，何建军，等.莲藕研究进展[J].氨基酸和生物资源，2004，26（1）：8-11.

[5] 李正理.植物制片技术[M].北京：科学出版社，1987.40.

[6] 崔堂兵，郭 勇，张长远.植物组织培养中褐变现象的产生机理及克服方法[J].广东农业科学，2001（3）：16-18.

[7] 陈桂芳，娄利华.植物组织培养中几个常见的技术问题[J].重庆林业科技，2003（4）：50-51.

[8] 何士敏，秦家顺，李 鹏.莲藕多酚氧化酶的催化特性检测[J].西南农业学报，2011，24（1）：75-79.

[9] 朱玉球，廖望仪，黄坚钦，等.山核桃愈伤组织诱导的初步研究[J].浙江林学院学报，2001，18（2）：115-118.

[10] 刁 英，吴金平，赵玲玲，等.莲胚性愈伤组织诱导研究初报[J].湖北农业科学，2011，50（14）：2991-2992.

2.2 莲藕愈伤组织诱导过程的组织学观察

采用正交试验得到的最佳培养基配方诱导莲藕愈伤组织，外植体接种后，每隔10 d取样1次，制片拍照，结果见图2。培养10 d左右，可见细胞核染色加深，核质比增大，细胞开始活跃分裂（图2a）；培养30 d左右，细胞内容物染色加深，细胞质浓厚，细胞分裂旺盛，愈伤组织形成，并出现少量单宁细胞（图2b）；培养50 d左右，可见大量细碎的染色较深的细胞，内部出现大量无规则的维管束（图2c），此时应及时转入新鲜培养基，若不及时转接，继续培养到60 d，则结构变得疏松，且出现大量染色很深的单宁细胞（图2d），此时，愈伤组织极易褐化死亡。

3 讨论

在莲藕组织培养过程中，污染比较严重，可能是莲藕本身存在很多空隙，其中的微生物在消毒灭菌过程中不容易被消灭，因此造成组织培养过程中较为严重的污染情况。可以采取一定的方法减少类似情况发生，比如取材要新鲜，切取顶芽或侧芽时尽量不要损伤芽体，以免暴露内部的空隙。

此外，褐化问题一直是莲藕组织培养过程中普遍存在的现象。分析原因，与莲藕中多酚氧化酶（PPO）活性较高有关[6，7]。切取的外植体在接触氧气后，切口处多酚类物质在PPO的作用下，氧化成醌，导致莲藕褐化，积累较多时，对外植体产生毒害[8]。从组织切片观察结果看，单宁类物质随着培养的时间加长而增加，而单宁是多酚高聚化合物。朱玉球等[9]在研究山核桃愈伤组织诱导过程中发现随着单宁物质含量的减少，愈伤组织形成部位向切口上移，说明单宁的存在可抑制愈伤组织的发生，本试验结果显示，培养时间越长，单宁含量越高，组织越容易褐化，愈伤组织的产生越少，因此分析单宁是导致莲藕极易褐化的主要原因之一。本试验中采取了多种方法抑制莲藕外植体的褐化。其中比较有效的方法包括及时继代，减少培养时间，可一定程度上减缓单宁物质的影响；另外，在培养基中添加一定量的活性炭，可吸附部分醌类，有效控制褐化现象，然而活性炭同时也吸附了其他的营养物质，对愈伤组织的生长和增殖有一定影响。因此，在培养初期采用活性炭，到后期组织情况稳定后，可不必再添加；此外，采用Gelrite替代琼脂作为固化剂可明显改善褐化情况，分析原因，可能是由于Gelrite成分更为纯净，在固化效果相同的情况下，用量少，一般仅为琼脂用量的1/3，甚至更少。因此，Gelrite固化剂渗透性强，使产生的醌更快扩散。

此外，莲藕的愈伤组织诱导率较低，一般最高仅为30%左右，相应的类似报道也不多见，刁英等[10]报道的莲藕愈伤诱导结果表明，最佳培养基为MS基本培养基+0.5 mg/L 6-BA+5.0 mg/L 2，4-D，最高诱导率可达32%，诱导率同样较低。因此，要达到实际生产的要求，还需要进一步研究更加适合的培养方案。

参看文献：

[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴（第一册）[M].北京：科学出版社，1994.646.

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[3] 陈丽萍，周可明，张志友.莲藕组织培养研究进展[J].现代农业科技，2008（20）：15-16.

[4] 刁 英，韩延闯，何建军，等.莲藕研究进展[J].氨基酸和生物资源，2004，26（1）：8-11.

[5] 李正理.植物制片技术[M].北京：科学出版社，1987.40.

[6] 崔堂兵，郭 勇，张长远.植物组织培养中褐变现象的产生机理及克服方法[J].广东农业科学，2001（3）：16-18.

[7] 陈桂芳，娄利华.植物组织培养中几个常见的技术问题[J].重庆林业科技，2003（4）：50-51.

[8] 何士敏，秦家顺，李 鹏.莲藕多酚氧化酶的催化特性检测[J].西南农业学报，2011，24（1）：75-79.

[9] 朱玉球，廖望仪，黄坚钦，等.山核桃愈伤组织诱导的初步研究[J].浙江林学院学报，2001，18（2）：115-118.

[10] 刁 英，吴金平，赵玲玲，等.莲胚性愈伤组织诱导研究初报[J].湖北农业科学，2011，50（14）：2991-2992.

2.2 莲藕愈伤组织诱导过程的组织学观察

采用正交试验得到的最佳培养基配方诱导莲藕愈伤组织，外植体接种后，每隔10 d取样1次，制片拍照，结果见图2。培养10 d左右，可见细胞核染色加深，核质比增大，细胞开始活跃分裂（图2a）；培养30 d左右，细胞内容物染色加深，细胞质浓厚，细胞分裂旺盛，愈伤组织形成，并出现少量单宁细胞（图2b）；培养50 d左右，可见大量细碎的染色较深的细胞，内部出现大量无规则的维管束（图2c），此时应及时转入新鲜培养基，若不及时转接，继续培养到60 d，则结构变得疏松，且出现大量染色很深的单宁细胞（图2d），此时，愈伤组织极易褐化死亡。

3 讨论

在莲藕组织培养过程中，污染比较严重，可能是莲藕本身存在很多空隙，其中的微生物在消毒灭菌过程中不容易被消灭，因此造成组织培养过程中较为严重的污染情况。可以采取一定的方法减少类似情况发生，比如取材要新鲜，切取顶芽或侧芽时尽量不要损伤芽体，以免暴露内部的空隙。

此外，褐化问题一直是莲藕组织培养过程中普遍存在的现象。分析原因，与莲藕中多酚氧化酶（PPO）活性较高有关[6，7]。切取的外植体在接触氧气后，切口处多酚类物质在PPO的作用下，氧化成醌，导致莲藕褐化，积累较多时，对外植体产生毒害[8]。从组织切片观察结果看，单宁类物质随着培养的时间加长而增加，而单宁是多酚高聚化合物。朱玉球等[9]在研究山核桃愈伤组织诱导过程中发现随着单宁物质含量的减少，愈伤组织形成部位向切口上移，说明单宁的存在可抑制愈伤组织的发生，本试验结果显示，培养时间越长，单宁含量越高，组织越容易褐化，愈伤组织的产生越少，因此分析单宁是导致莲藕极易褐化的主要原因之一。本试验中采取了多种方法抑制莲藕外植体的褐化。其中比较有效的方法包括及时继代，减少培养时间，可一定程度上减缓单宁物质的影响；另外，在培养基中添加一定量的活性炭，可吸附部分醌类，有效控制褐化现象，然而活性炭同时也吸附了其他的营养物质，对愈伤组织的生长和增殖有一定影响。因此，在培养初期采用活性炭，到后期组织情况稳定后，可不必再添加；此外，采用Gelrite替代琼脂作为固化剂可明显改善褐化情况，分析原因，可能是由于Gelrite成分更为纯净，在固化效果相同的情况下，用量少，一般仅为琼脂用量的1/3，甚至更少。因此，Gelrite固化剂渗透性强，使产生的醌更快扩散。

此外，莲藕的愈伤组织诱导率较低，一般最高仅为30%左右，相应的类似报道也不多见，刁英等[10]报道的莲藕愈伤诱导结果表明，最佳培养基为MS基本培养基+0.5 mg/L 6-BA+5.0 mg/L 2，4-D，最高诱导率可达32%，诱导率同样较低。因此，要达到实际生产的要求，还需要进一步研究更加适合的培养方案。

参看文献：

[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴（第一册）[M].北京：科学出版社，1994.646.

[2] 张建福，王 锋.莲藕的组织培养现状与展望[J].上海农业科技，2000（4）：10.

[3] 陈丽萍，周可明，张志友.莲藕组织培养研究进展[J].现代农业科技，2008（20）：15-16.

[4] 刁 英，韩延闯，何建军，等.莲藕研究进展[J].氨基酸和生物资源，2004，26（1）：8-11.

[5] 李正理.植物制片技术[M].北京：科学出版社，1987.40.

[6] 崔堂兵，郭 勇，张长远.植物组织培养中褐变现象的产生机理及克服方法[J].广东农业科学，2001（3）：16-18.

[7] 陈桂芳，娄利华.植物组织培养中几个常见的技术问题[J].重庆林业科技，2003（4）：50-51.

[8] 何士敏，秦家顺，李 鹏.莲藕多酚氧化酶的催化特性检测[J].西南农业学报，2011，24（1）：75-79.

[9] 朱玉球，廖望仪，黄坚钦，等.山核桃愈伤组织诱导的初步研究[J].浙江林学院学报，2001，18（2）：115-118.

[10] 刁 英，吴金平，赵玲玲，等.莲胚性愈伤组织诱导研究初报[J].湖北农业科学，2011，50（14）：2991-2992.