川中黑山羊RBP4基因cDNA克隆及序列分析

龙石太+吴宪红+胡亮+字向东

摘要：以川中黑山羊肝脏组织总RNA为模板，通过RT-PCR技术对黑山羊RBP4基因进行克隆测序及序列分析。结果表明，所克隆的665 bp片段为预期的川中黑山羊RBP4基因cDNA序列，包含整个CDS区，该编码区长为606 bp，编码201个氨基酸。用DNAMAN软件进行同源性比对，结果显示，川中黑山羊RBP4基因编码区与GenBank中报道的牛、猪、马、黑猩猩、小鼠、大鼠、人的同源性分别是98.5%、91.3%、92.2%、91.4%、83.0%、82.3%、91.3%；氨基酸序列同源性分别为97.5%、91.5%、93.5%、91.5%、83.6%、83.6%、91.5%。利用NJ法和MP法以该基因编码区核苷酸序列构建物种间分子进化树，其结果基本一致。聚类结果与遗传距离大小一致，表明RBP4基因编码区适用于构建物种间分子系统进化树。

关键词：川中黑山羊；RBP4基因；分子克隆；序列分析

中图分类号：S826；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0697-04

视黄醇结合蛋白（Retinol-binding proteins，RBPs）是存在于动物体内以实现维生素A从肝细胞内转运至靶组织，并参与血清和细胞内视黄酸、视黄醇转运代谢的一种特异性运载蛋白，类属于疏水小分子结合蛋白家族[1]。RBPs在协助维生素A发挥生理功能中起着不可替代的作用。首先，RBP与维生素A结合后再与甲状腺素运载蛋白结合，形成VA-RBP-TTR复合体，伴随血液循环流经靶组织，与RBP的可识别受体结合，然后将维生素A转运到细胞内的受体上，以此完成其运载功能[2]。RBP主要在肝脏细胞中合成，合成后释放到血液中，最后通过内循环进入动物体内各组织。但RBP基因的mRNA在哺乳动物的卵巢、输卵管、卵泡、黄体、子宫内膜、肝脏、小肠、睾丸和附睾等多种组织中都有表达，只是在不同物种、组织器官和不同发育时期存在表达差异[3]。研究显示，视黄醇结合蛋白4基因（RBP4）在猪妊娠关键期的转运作用和胚胎发育过程中发挥重要作用，从而影响猪的产仔数[3，4]，RBP4是产生孕体的主要蛋白质之一。

目前，有关RBP基因在人、猪、牛、绵羊、小鼠、大鼠等物种中的研究均有报道，但在山羊物种中的研究尚未见报道。繁殖性状是山羊最为重要的经济性状，提高山羊产活羔率是增加山羊经济价值的重要手段，提高山羊繁殖力则普遍成为世界养羊业所追求的目标。而川中黑山羊是经过长期自然选择和人工重点选育的多胎山羊品种，具有性成熟早（母羊初情期为3～4月龄，初配年龄为5～6月龄）、产仔率高（平均产羔率为270%）、生长速度快、产肉性能好、耐粗食、抗病力强、适应性良好等优点[4，5]。

本研究以川中黑山羊为研究对象，首次对山羊的RBP4基因CDS区进行克隆测序及序列分析，与GenBank中其他物种的相应基因进行序列比对，并在此基础上构建物种间分子系统进化树，以期为进一步开展川中黑山羊RBP4基因的定位、表达调控以及繁殖性状的相关分析等提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从四川省乐至县天龙科技示范园选取6只3～5岁健康的黑山羊，屠宰后采集肝脏组织，迅速放置在室温生理盐水中，并冲洗3次，放于RNA later 中，然后放置到盛有液氮的液氮罐中保存，带回实验室保存于超低温冰箱（-70 ℃）中，用于RNA提取。

1.2 主要试剂和仪器

动物组织总RNA提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、感受态细胞均购自天根生化科技（北京）有限公司，反转录试剂盒购自FERMENTAS（MBI）公司，X-Gal、IPTG、氨苄青霉素（Ampr）、克隆载体PMD-19 Vector购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1.3 总RNA的提取

依据动物组织总RNA提取试剂盒（离心柱型）提取川中黑山羊肝脏总RNA。依据反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。

1.4 引物设计及目的基因PCR扩增

参考GenBank已公布的牛视黄醇结合蛋白（RBP4）基因（登录号：NM_001040475）的mRNA序列，应用 Primer Premier 5 设计1对引物，预期扩增片段长度为 665 bp，引物序列送上海英俊生物有限公司合成（表1）。以合成的川中黑山羊肝脏cDNA为模板，构建25 μL PCR扩增体系。上、下游引物各1 μL，cDNA模板0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix酶12.5 μL，水10 μL。PCR 扩增程序为：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 变性40 s，60 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，35个循环；72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保存。PCR反应产物以1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 克隆及重组子筛选和鉴定

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，按DNA胶回收试剂盒说明进行胶回收，回收产物与PMD-19 载体在16 ℃ 连接过夜。连接反应产物转化宿主菌5α 感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体平板上，37 ℃培养过夜。挑选白色单克隆菌落于LB液体培养基上，37 ℃振荡培养12 h，取菌液进行PCR阳性重组子鉴定，并提取重组质粒。

1.6 序列及系统进化分析

将重组质粒送上海英俊生物有限公司测序。测序结果用DNAMAN 4.0 软件拼接后，与GenBank 中已公布的牛、猪、马、人、黑猩猩、大鼠、小鼠的RBP4基因进行比对，分析其在核苷酸和相应的氨基酸序列上的异同，并使用Mega 4.0 软件构建物种间系统进化树。

2 结果与分析

2.1 RBP4基因PCR电泳结果

以川中黑山羊肝脏cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳（电泳缓冲液为1×TBE）检测后，得到与预期大小（665 bp）一致的片段（图1）。

2.2 重组子鉴定

挑选8个单克隆菌落37 ℃摇菌，培养5 h后，从每管培养基中抽取1 μL作为模板，以原引物进行PCR 反应，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增的目的片段的大小，结果与预期结果一致（图2），然后将鉴定后的阳性菌液送上海英俊生物有限公司测序。

2.3 川中黑山羊RBP4基因CDS序列分析

利用DNAMAN 4.0对测序结果进行拼接，得到665 bp的片段，与预期结果相符。RBP4基因测序结果如图3所示。用ORF查找器（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找RBP4的开放性阅读框并翻译出氨基酸序列，结果表明，RBP4基因含有一个606 bp的可读框，起始密码子为ATG（编码蛋氨酸），终止密码子为TAG （不编码氨基酸），编码201个AA。

2.4 RBP4基因核苷酸、氨基酸序列的同源性比对

2.4.1 核苷酸序列比对及遗传距离 将所得的RBP4基因CDS区与GenBank中查找的其他物种RBP4的CDS区进行比对，计算其序列相似性与遗传距离。核苷酸序列比对结果表明，参与比对的各物种RBP4基因编码区长度相同，均为606 bp， 没有发现不同物种间的特异插入或缺失。

经比对（表2），川中黑山羊RBP4基因 CDS 区与牛（NM_001040475）、猪（NM_214057）、马（NM_001081951）、黑猩猩（NM_001045495）、小鼠（NM_001159487）、大鼠（NM_013162）、人（NM_006744）的同源性分别是98.5%、91.3%、92.2%、91.4%、83.0%、82.3%、91.3%，表明川中黑山羊RBP4基因的CDS区较保守。

由核苷酸序列推导的氨基酸序列比对结果（表2）可知，川中黑山羊RBP4的氨基酸序列与牛、猪、马、黑猩猩、小鼠、大鼠、人的同源性分别为97.5%、91.5%、93.5%、91.5%、83.6%、83.6%、91.5%。

2.4.2 物种间分子系统进化树 采用邻接法（NJ）和最大简约法（MP）对川中黑山羊、牛、马、猪、人、黑猩猩、大鼠、小鼠的核苷酸序列分别构建物种间分子系统进化树（图4、图5），利用Clustal X软件进行同源性比对，并计算RBP4基因核苷酸及推导氨基酸序列的遗传距离（表3）。结果表明，2种方法构建的物种间分子系统进化树基本一致，且遗传距离的大小、核苷酸及推导氨基酸序列的同源性一致。

3 小结与讨论

3.1 川中黑山羊RBP4基因核苷酸及其推导氨基酸序列分析

参与比对的各物种RBP4基因编码区均为606 bp，无种属特异性插入和缺失。采用DNAMAN、Clustal X软件进行同源性比对，结果表明川中黑山羊RBP4基因CDS区核苷酸序列与牛、猪、马、黑猩猩、人的同源性都在90%以上，与川中黑山羊亲缘关系最近的是牛，同源性高达98.5%，二者有10处核苷酸的差异；与小鼠、大鼠同源性为83.0%、82.3%，表明川中黑山羊RBP4基因的CDS区较保守。川中黑山羊RBP4基因与牛科动物遗传距离很小，仅为0.015，与大鼠的遗传距离最大，为0.177，表明川中黑山羊与牛的亲缘关系最近，与鼠的亲缘关系最远。

川中黑山羊RBP4基因推导氨基酸序列与查找的各物种同源性比对结果基本一致，其亲缘关系远近与核苷酸序列比对结果也基本一致。氨基酸序列比对结果显示，与川中黑山羊亲缘关系最近的是牛。

3.2 物种间分子进化关系

川中黑山羊与牛、猪、马、人、黑猩猩、鼠等物种间的分子系统进化树的构建结果表明，NJ法构建的系统树各分支置信度均在98以上，其中，川中黑山羊与牛聚类时置信度达100；MP法构建的系统树中，川中黑山羊和牛聚类时的置信度也达到100，除了人和猪聚类时的置信度为90以外，其他分支的置信度均在98以上，说明这2种方法的聚类结果可靠性较强。从聚类结果可以看出，川中黑山羊首先与牛聚为一类，再与马聚为一类，然后与人、猪聚类，最后与鼠科动物聚类。该分子系统进化树较准确、真实地反映了各物种间的进化关系和亲缘关系，即亲缘关系越近的物种，同源性越高，遗传距离越小。

3.3 RBP4基因作为动物繁殖力候选基因

RBP4基因作为猪的繁殖力相关的候选基因已经被广泛研究。杨龙等[3]对长白、大白、民猪、杜洛克和杂种猪5种猪的多态性进行研究，发现这5种猪均表现为中度多态性，民猪的B等位基因为优势等位基因，推测B等位基因与猪的多胎性状相关。罗仍卓么等[6]对北京黑猪RBP4基因的多态性进行研究，发现BB型比AA型和AB型的总产仔数分别多1.04头和0.31头，B等位基因的加性效应为0.282头/窝。朱吉等[7]对湖南黑猪的研究发现，初产母猪的BB基因型比AA基因型个体总产仔数、产活仔数分别多1.66、1.83头。该研究结论进一步支持了B等位基因可能为猪繁殖性能的优势等位基因。Rothschild等[8]对6个商品系1 300头母猪的2 555头仔猪进行了RBP4标记基因型检测，其加性效应分别为0.23 头/窝（总产仔数）和0.15 头/窝（产活仔数），表明RBP4基因对产仔数存在中等增强的效应。Ollivier等[9]分析了高产仔系和对照组母猪，估计RBP4基因的加性效应为0.4头/窝。Linville等[10]报道了RBP4对总产仔数的加性效应为0.179头/窝，对产活仔数的加性效应为0.526头/窝。因此，RBP4基因可作为猪的一个较为合理的产仔数候选基因。

RBP4基因作为绵羊的繁殖力候选基因的研究也有报道，何远清等[11]以RBP4为候选基因，检测 RBP4基因在高繁殖力绵羊品种（湖羊、小尾寒羊）和低繁殖力绵羊品种（萨福克羊、多赛特羊）中的单核苷酸多态性。结果发现，RBP4基因在4个绵羊品种中均存在多态性，且BB基因型小尾寒羊产羔数分别比AA和AB基因型多0.52只和0.67只。表明RBP4基因与小尾寒羊高繁殖力相关。在山羊种中，RBP4基因作为繁殖力候选基因尚未见报道，本研究对川中黑山羊RBP4基因编码区进行克隆，旨在为开展山羊RBP4基因的相关研究提供理论支持。

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RBP4基因作为绵羊的繁殖力候选基因的研究也有报道，何远清等[11]以RBP4为候选基因，检测 RBP4基因在高繁殖力绵羊品种（湖羊、小尾寒羊）和低繁殖力绵羊品种（萨福克羊、多赛特羊）中的单核苷酸多态性。结果发现，RBP4基因在4个绵羊品种中均存在多态性，且BB基因型小尾寒羊产羔数分别比AA和AB基因型多0.52只和0.67只。表明RBP4基因与小尾寒羊高繁殖力相关。在山羊种中，RBP4基因作为繁殖力候选基因尚未见报道，本研究对川中黑山羊RBP4基因编码区进行克隆，旨在为开展山羊RBP4基因的相关研究提供理论支持。

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