喜树内生真菌产喜树碱菌株的筛选及药化研究
2014-07-21曹晋静康冀川
曹晋静+康冀川
摘要：采用PDA培养基对151株喜树内生真菌进行发酵，未筛选出产喜树碱及其类似物的内生真菌，而采用喜树种子煎汁作为诱导物进行诱导培养，即在PDA培养基中加入了喜树种子的煎汁，结果从151株内生真菌中共筛选到4株能产生喜树碱及其类似物的内生真菌，其中产喜树碱的3株，产10-羟基喜树碱的1株。试验筛选出了能产喜树碱及其类似物的内生真菌。
关键词：喜树；喜树碱；内生真菌
中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0565-04
喜树 （Camptothecaa cuminata Decne.）又名旱莲木、千仗树，属珙桐科（蓝果树科、紫树科）（Nyssaceae）喜树属（Camptotheca Decne.），多年生亚热带落叶阔叶树，是我国特有的树种，在我国的分布较为广阔，南至云南的西双版纳，北至山西秦岭地区[1]。喜树中含有多种有活性的化合物，如喜树碱、喜树次碱，10-羟基喜树碱等。研究表明，喜树碱及其衍生物具有显著的抗肿瘤活性，现已用于直肠癌及卵巢癌的临床治疗[2]。从植物内生真菌与寄主植物同步演化关系推测，喜树内生真菌的代谢产物中可能含有喜树碱及其衍生物[3]。目前对于喜树的研究主要集中在喜树碱及其衍生物的提取、纯化、检测等工艺上，而对其内生真菌代谢产物的研究报道较少。以内生真菌与植物的特殊关系为切入点研究喜树内生真菌与喜树碱及其衍生物的相关性，可以为喜树碱及其衍生物的开发以及为寻找新型抗癌药物开辟一条新的道路。
1 材料与方法
1.1 材料及培养基
从喜树根、茎、叶、果实中分离得到151株内生真菌。
马铃薯葡萄糖（PDA）培养基：沸煮后的马铃薯汁加葡萄糖20 g，不加琼脂，灭菌。喜树种子煎汁培养基：称取50 g喜树种子粉碎后煮沸30 min，添加到100 mL PDA培养基中。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配制 分别精确称取喜树碱及10-羟基喜树碱标准品0.002 5 g，置于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析纯）溶解，超声波助溶，最后定容，浓度分别为0.1、0.05 mg/mL。
1.2.2 菌株的发酵及样品溶液的制备 采用两种培养基对待测菌株进行液体发酵，一是PDA培养基，二是喜树种子煎汁培养基。灭菌后接入一定量的菌丝体， 28 ℃、120 r/min 旋转培养，7 d后将发酵液用2层纱布过滤得到菌丝球，40 ℃干燥，粉碎。
菌丝体处理方法：称取1.5～2.0 g粉碎后的菌丝，加入甲醇（分析纯）5 mL，超声波破碎30 min，静置24 h，取其上清液并用甲醇补足损失的重量，12 000 r/min离心10 min，重复两次，0.45 μm纤维虑膜过滤。发酵液处理方法：将发酵液装入旋转蒸发仪中，50 ℃旋转蒸发至干，加入5 mL甲醇（色谱纯）溶解，超声波30 min助溶，静置24 h后用0.45 μm油性纤维滤膜过滤2～3次。
1.2.3 HPLC色谱条件 C18柱（直径15 cm×4 mm ID），检测波长360 nm，流速0.8 mL/min，柱温55 ℃，流动相甲醇、水体积比为4∶6，进样体积10 μL。
1.2.4 标准曲线的绘制 将喜树碱标准液的浓度分别稀释成0.004、0.005、0.006、0.007、0.008 mg/mL。10-羟基喜树碱标准液的浓度稀释成：0.002 5、0.003 0、0.003 5、0.004 0、0.004 5 mg/mL。按照“1.2.3”的色谱条件进样测定，每个浓度重复3次，取峰面积平均值，得出峰面积（y）与浓度（x）的线性回归方程。
2 结果与分析
2.1 产喜树碱或10-羟基喜树碱菌株的初筛结果
分别对内生真菌的发酵液和菌丝体提取液进行处理，采用TLC法初步筛选发现，用PDA培养基培养的内生真菌发酵液和菌丝体不含喜树碱或10-羟基喜树碱；用喜树种子煎汁培养基培养的内生真菌，其发酵液不含喜树碱或10-羟基喜树碱，但在菌丝体提取液中发现有3株内生真菌的检测斑点与喜树碱标准品的斑点相对应（标准品Rf=0.80，样品Rf值分别是0.79、0.82、0.82），这3株菌分别是QZ04、CY02和XY09，见图1；并且还发现有1株编号为XY05的内生真菌的检测斑点与10-羟基喜树碱标准品的斑点相对应（标准品Rf=0.60，样品Rf=0.62），见图2。初步判断为是产活性产物的菌株，并对其进行了形态学和分子生物学的鉴定，还需用HPLC法再进行定性定量的检测。
2.2 产喜树碱或10-羟基喜树碱菌株的定性分析
2.2.1 标准品的HPLC图 标准品的HPLC图谱见图3。喜树碱标准品保留时间为12.732 min，峰面积为965.212 mAU；10-羟基喜树碱标品保留时间为7.293 min，峰面积为1 805.47 mAU。
2.2.2 样品的HPLC图 产喜树碱菌株提取物的HPLC图谱见图4。产10-羟基喜树碱菌株提取物的HPLC图谱见图5。
比较标准品与4个样品的HPLC检测峰图，发现4个样品均有与标准品相似的保留时间（表1、表2）。综合试验结果可以判断样品中确实含有喜树碱及其类似物。
2.2.3 菌株中喜树碱、10-羟基喜树碱的含量测定 通过绘制标准曲线，可以较准确地计算出内生真菌产喜树碱或10-羟基喜树碱的含量。喜树碱和10-羟基喜树碱标准曲线分别见图6、图7。
建立回归方程，喜树碱：y=19 058x-0.4913（r=0.999 8）；10-羟基喜树碱：y=35 357x+0.144 1（r=0.999 7）。将所测样品的峰面积代入回归方程计算浓度，再换算出QZ04内生真菌喜树碱产量为0.029 mg/g，CY02为0.024 mg/g，XY09为0.037 mg/g；XY05 10-羟基喜树碱的产量为0.017 mg/g。
3 小结与讨论
1）试验采用TLC法和HPLC法从151株内生真菌中共筛选到4株能产生喜树碱及其类似物的内生真菌，其中产喜树碱的3株，产10-羟基喜树碱的1株。后经形态学和分子生物学的鉴定[4，5]，这4株菌分别为QZ04（链格孢属，Alternaria sp.）、CY02（拟茎点霉属，Phomopsis sp.）、XY09（镰孢属，Fusarium sp.）、XY05（刺盘孢属，Colletotrichum sp.）。
2）根据植物内生真菌与宿主植物在长期的适应进化过程中，也可能会使内生真菌产生与宿主植物相同或相似的活性代谢产物，即共生理论[6]。因此本试验采用了喜树种子煎汁作为诱导物进行诱导培养，并作了对照试验，即使用不加诱导物的PDA培养基培养。结果发现，未加诱导物发酵的菌株均不产喜树碱及其类似物。此外，为进一步确定喜树碱是由内生真菌产生而不是来自于种子煎汁，本试验还同时检测了种子煎汁PDA培养基中是否含有喜树碱或10-羟基喜树碱，结果未检测出。表明了这4株喜树内生真菌确实是在喜树种子产生的某种前体物质刺激下产生了喜树碱及其类似物。
3）喜树植株的器官均能产生喜树碱及其衍生物，然而在叶子和种子中，喜树碱的含量更高[7]。分离到的这4株产喜树碱或10-羟基喜树碱的内生真菌有3株来自喜树叶，1株来自喜树种子。可能因为叶子和种子内喜树碱的高含量，才使得该部位的内生真菌具有产活性产物的能力。也可能是因为受到喜树叶子和种子自身内生真菌一些次生代谢的影响，才使得叶子和种子的喜树碱含量高于其他部位。具体情况有待进一步的研究。
4）试验加入了50 g喜树种子煎汁作为诱导物进行发酵，较刘蕴哲[7]的20 g虽有所增多，但活性物质的产量却没有成线性增长，含量在0.017～0.037 mg/g，不及刘蕴哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下两点：第一，不同种类的内生真菌产活性产物的能力有所不同，高产菌株还有待进一步的筛选；第二，所加入的诱导物太多或太少都不利于内生真菌活性产物的产生，有研究报道指出，喜树碱在某种程度上也会阻碍自身内生真菌的生长[8]。诱导物最适量还有待进一步研究。
尽管已分离出了产喜树碱及其类似物的内生真菌，但这些真菌菌丝体提取液中喜树碱的含量很低，还远远达不到大规模生产的水平，满足不了商业化生产的要求，因此要想投入市场满足人们的需求还必须通过一系列的手段和途径来提高内生真菌产喜树碱的产量。目前除了改变培养液的营养成分，如在发酵液中添加前体诱导物外，还可寻找一些真菌代谢调节剂，抑制其他的次生代谢途径等。
现代生物技术的应用是提高内生真菌活性物质产量的一个有效途径，利用原生质体融合技术对内生真菌进行遗传改造，通过原生质体诱变，遗传转化，以及基因调控等分子手段也有望解决内生真菌活性代谢产物产量低的问题。
参考文献：
[1] 李 星.喜树的分布现状、药用价值及发展前景[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2004（S2）：169-173.
[2] 李立源，张冬艳，白凤武. 喜树碱及其衍生物的研究进展[J].大连民族学院学报，2001，3（4）：17-22.
[3] 郭良栋.内生真菌研究进展[J].菌物系统，2001，20（1）：148-152.
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[6] 李承森.植物科学进展[M].第二版.北京：高等教育出版社，1999，183-190.
[7] 刘蕴哲.喜树生态系内生真菌的分子鉴定及药物化学研究[D].贵阳：贵州大学，2006.
[8] 刘文哲，张爱新，REINSCHEID U M.喜树内生菌与喜树碱的关系[J].西北植物学报，2003，23（7）：1275-1278.
3 小结与讨论
1）试验采用TLC法和HPLC法从151株内生真菌中共筛选到4株能产生喜树碱及其类似物的内生真菌，其中产喜树碱的3株，产10-羟基喜树碱的1株。后经形态学和分子生物学的鉴定[4，5]，这4株菌分别为QZ04（链格孢属，Alternaria sp.）、CY02（拟茎点霉属，Phomopsis sp.）、XY09（镰孢属，Fusarium sp.）、XY05（刺盘孢属，Colletotrichum sp.）。
2）根据植物内生真菌与宿主植物在长期的适应进化过程中，也可能会使内生真菌产生与宿主植物相同或相似的活性代谢产物，即共生理论[6]。因此本试验采用了喜树种子煎汁作为诱导物进行诱导培养，并作了对照试验，即使用不加诱导物的PDA培养基培养。结果发现，未加诱导物发酵的菌株均不产喜树碱及其类似物。此外，为进一步确定喜树碱是由内生真菌产生而不是来自于种子煎汁，本试验还同时检测了种子煎汁PDA培养基中是否含有喜树碱或10-羟基喜树碱，结果未检测出。表明了这4株喜树内生真菌确实是在喜树种子产生的某种前体物质刺激下产生了喜树碱及其类似物。
3）喜树植株的器官均能产生喜树碱及其衍生物，然而在叶子和种子中，喜树碱的含量更高[7]。分离到的这4株产喜树碱或10-羟基喜树碱的内生真菌有3株来自喜树叶，1株来自喜树种子。可能因为叶子和种子内喜树碱的高含量，才使得该部位的内生真菌具有产活性产物的能力。也可能是因为受到喜树叶子和种子自身内生真菌一些次生代谢的影响，才使得叶子和种子的喜树碱含量高于其他部位。具体情况有待进一步的研究。
4）试验加入了50 g喜树种子煎汁作为诱导物进行发酵，较刘蕴哲[7]的20 g虽有所增多，但活性物质的产量却没有成线性增长，含量在0.017～0.037 mg/g，不及刘蕴哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下两点：第一，不同种类的内生真菌产活性产物的能力有所不同，高产菌株还有待进一步的筛选；第二，所加入的诱导物太多或太少都不利于内生真菌活性产物的产生，有研究报道指出，喜树碱在某种程度上也会阻碍自身内生真菌的生长[8]。诱导物最适量还有待进一步研究。
尽管已分离出了产喜树碱及其类似物的内生真菌，但这些真菌菌丝体提取液中喜树碱的含量很低，还远远达不到大规模生产的水平，满足不了商业化生产的要求，因此要想投入市场满足人们的需求还必须通过一系列的手段和途径来提高内生真菌产喜树碱的产量。目前除了改变培养液的营养成分，如在发酵液中添加前体诱导物外，还可寻找一些真菌代谢调节剂，抑制其他的次生代谢途径等。
现代生物技术的应用是提高内生真菌活性物质产量的一个有效途径，利用原生质体融合技术对内生真菌进行遗传改造，通过原生质体诱变，遗传转化，以及基因调控等分子手段也有望解决内生真菌活性代谢产物产量低的问题。
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1）试验采用TLC法和HPLC法从151株内生真菌中共筛选到4株能产生喜树碱及其类似物的内生真菌，其中产喜树碱的3株，产10-羟基喜树碱的1株。后经形态学和分子生物学的鉴定[4，5]，这4株菌分别为QZ04（链格孢属，Alternaria sp.）、CY02（拟茎点霉属，Phomopsis sp.）、XY09（镰孢属，Fusarium sp.）、XY05（刺盘孢属，Colletotrichum sp.）。
2）根据植物内生真菌与宿主植物在长期的适应进化过程中，也可能会使内生真菌产生与宿主植物相同或相似的活性代谢产物，即共生理论[6]。因此本试验采用了喜树种子煎汁作为诱导物进行诱导培养，并作了对照试验，即使用不加诱导物的PDA培养基培养。结果发现，未加诱导物发酵的菌株均不产喜树碱及其类似物。此外，为进一步确定喜树碱是由内生真菌产生而不是来自于种子煎汁，本试验还同时检测了种子煎汁PDA培养基中是否含有喜树碱或10-羟基喜树碱，结果未检测出。表明了这4株喜树内生真菌确实是在喜树种子产生的某种前体物质刺激下产生了喜树碱及其类似物。
3）喜树植株的器官均能产生喜树碱及其衍生物，然而在叶子和种子中，喜树碱的含量更高[7]。分离到的这4株产喜树碱或10-羟基喜树碱的内生真菌有3株来自喜树叶，1株来自喜树种子。可能因为叶子和种子内喜树碱的高含量，才使得该部位的内生真菌具有产活性产物的能力。也可能是因为受到喜树叶子和种子自身内生真菌一些次生代谢的影响，才使得叶子和种子的喜树碱含量高于其他部位。具体情况有待进一步的研究。
4）试验加入了50 g喜树种子煎汁作为诱导物进行发酵，较刘蕴哲[7]的20 g虽有所增多，但活性物质的产量却没有成线性增长，含量在0.017～0.037 mg/g，不及刘蕴哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下两点：第一，不同种类的内生真菌产活性产物的能力有所不同，高产菌株还有待进一步的筛选；第二，所加入的诱导物太多或太少都不利于内生真菌活性产物的产生，有研究报道指出，喜树碱在某种程度上也会阻碍自身内生真菌的生长[8]。诱导物最适量还有待进一步研究。
尽管已分离出了产喜树碱及其类似物的内生真菌，但这些真菌菌丝体提取液中喜树碱的含量很低，还远远达不到大规模生产的水平，满足不了商业化生产的要求，因此要想投入市场满足人们的需求还必须通过一系列的手段和途径来提高内生真菌产喜树碱的产量。目前除了改变培养液的营养成分，如在发酵液中添加前体诱导物外，还可寻找一些真菌代谢调节剂，抑制其他的次生代谢途径等。
现代生物技术的应用是提高内生真菌活性物质产量的一个有效途径，利用原生质体融合技术对内生真菌进行遗传改造，通过原生质体诱变，遗传转化，以及基因调控等分子手段也有望解决内生真菌活性代谢产物产量低的问题。
参考文献：
[1] 李 星.喜树的分布现状、药用价值及发展前景[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2004（S2）：169-173.
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[4] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.
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[7] 刘蕴哲.喜树生态系内生真菌的分子鉴定及药物化学研究[D].贵阳：贵州大学，2006.
[8] 刘文哲，张爱新，REINSCHEID U M.喜树内生菌与喜树碱的关系[J].西北植物学报，2003，23（7）：1275-1278.
