三七总皂苷对大鼠腹部游离皮瓣存活的影响
2014-07-18郅克谦许志鹏张瑞智
王 智,郅克谦,许志鹏,张瑞智
·论著·
三七总皂苷对大鼠腹部游离皮瓣存活的影响
王 智1a,郅克谦1b*,许志鹏2,张瑞智3
目的 观察三七总皂苷对大鼠腹部游离皮瓣氧化应激、血液流变学以及皮瓣存活率的影响,初步探讨三七总皂苷影响皮瓣存活的可能机制。方法 健康清洁雄性SD大鼠144只,随机平均分为假手术组(SO组),缺血再灌注组(IR组)和三七总皂苷干预组(PNS组)。建立大鼠右下腹部游离皮瓣模型。在术前30 min分别给予生理盐水(SO组、IR组)、三七总皂苷注射液(PNS组)腹腔注射,一次性给药。术后检测各组大鼠血液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及血液流变学指标,并观察皮瓣成活率。结果 IR组、PNS组于皮瓣组织再灌注后(即血管吻合成功后)4、8、24 h 3个时点,MDA含量均高于SO组,SOD活性及血液流变学指标则低于SO组(P<0.05);同时,PNS组在这3个时点的各项指标又优于IR组(P<0.05)。皮瓣成活率为:缺血再灌注组<三七总皂苷组<假手术组(P<0.01)。结论 三七总皂苷能通过改善微循环和提高机体抗氧化的能力,促进皮瓣成活。
游离皮瓣;氧化应激;血液流变学;三七总皂苷
0 引言
在整形和显微外科等领域,由于游离皮瓣能够较大距离转移,修复面积较大,因此,经常被应用于肿瘤切除、创伤、慢性溃疡或其他疾病造成的软组织缺损的修复重建中,以达到创面修复、功能重建及形态恢复的目的。但在游离皮瓣远位移植后,各种原因引起的皮瓣部分或全部坏死严重影响了组织缺损区外观的改善和功能重建。现有研究认为,移植后的皮瓣血供单一、侧支循环缺乏造成的局部组织缺血、缺氧,血液循环障碍尤其是微循环障碍导致皮瓣的局部缺血、瘀血、血栓形成等是导致皮瓣部分或全部坏死的始动因素[1]。值得关注的是近年来研究表明,皮瓣缺血、缺氧造成的局部组织内环境紊乱、氧自由基所致的脂质过氧化、细胞内钙超载,也是影响皮瓣成活的重要因素[2]。因此,如果能在游离皮瓣移植后,利用某些影响因素减轻微循环障碍和缺血再灌注损伤,防止皮瓣坏死和提高移植成活率,将对临床改善皮瓣修复术后患者的预后有着极为重要的意义。
三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)具有多种生物学活性和药理作用,相关研究表明其能清除自由基,防止脂质过氧化损伤,松弛血管平滑肌而缓解微动脉痉挛、降低微小血管阻力、减轻血管内皮损伤;抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流变学特征[3]。本实验建立大鼠腹部游离皮瓣模型,观察不同时段各组皮瓣的血液流变学、生化指标的变化,探讨三七总皂苷对游离皮瓣成活的影响及作用机制,为临床防治皮瓣坏死提供客观的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 选用雄性清洁级SD大鼠144只,鼠龄80 d左右,体重(340±20) g,由西安交通大学医学院动物实验中心提供。术前在恒湿恒温环境下饲养1周,手术前12 h禁饮食。注射用三七总皂苷(购自昆明兴中制药有限责任公司),超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(购自上海普林斯顿生物科技发展有限公司),北京中勤世帝LG-R-80A血液黏度仪(由本院检验科提供)。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组 144只大鼠随机平均分为假手术组(SO组),缺血再灌注组(IR组)和三七总皂苷干预组(PNS组),每组48只。其中,每组随机选取8只大鼠用于检测皮瓣成活率,剩余40只大鼠再按皮瓣组织取材的5个相应时间点即切断股动静脉前、再灌注前(即血管吻合成功前)、再灌注后(即血管吻合成功后)4、8、24 h分成5个亚组(分别计为T1~5),每组8只。
1.2.2 模型制备 参照Ozkan[4]方法,在各组大鼠右下腹部设计一块大小为4.0 cm×3.0 cm游离皮瓣(皮瓣的蒂部靠近腹股沟),此皮瓣的血供主要由股动、静脉分支的腹壁浅动、静脉供应。消毒后沿设计线切至腹外斜肌肌膜浅层,自头端向尾端钝性分离皮瓣,分离出股动、静脉主干及腹壁浅动、静脉,结扎并剪断股动、静脉远端,保留接连皮瓣的腹壁浅动、静脉作为蒂部相连,以保证其为惟一的血供。SO组:游离皮瓣制备完成后原位缝合,不做任何处理;IR、PNS组:仔细分离近心端股动静脉;于股动静脉发出腹壁浅动、静脉处上方1.0 cm左右上微血管夹并切断股动、静脉,两断端先后用肝素、利多卡因、生理盐水冲洗后,在外科显微镜下以11/0无创缝合线依次吻合股静脉及股动脉,松开微血管夹,确认腹壁浅血管血流恢复、皮瓣颜色逐步红润为血管吻合成功(吻合时间不超过2 h),最后原位缝合皮瓣。
1.2.3 给药方法 术前30 min,SO组和IR组腹腔注射生理盐水4 mL/kg,PNS组分别腹腔注射三七总皂苷40 mg/kg,注射点避开皮瓣,给药位置达皮瓣正下方。
1.2.4 取材和处理 各实验组所分亚组内的共120只大鼠按如前所述T1~55个相应时间点,分别于皮瓣近蒂处取成活的全层皮瓣组织一块,大小约1.0 cm×0.5 cm×0.2 cm,于-85 ℃冰箱留存待做生化检测。各亚组大鼠在完成皮瓣组织取材同时,从股动脉中抽全血5 mL,置于肝素钠抗凝管,立即进行血液流变学检测。
1.2.5 观察指标 (1)皮瓣成活率:术后第7 d观察三组先前确定的24只大鼠腹部皮瓣情况,以皮瓣呈粉红色,触之柔软,弹性较好认为成活;以皮瓣失去弹性,大部分呈灰黑色结痂认为坏死。用数码相机对24只大鼠皮瓣拍照后,采用Leica Q 550 CW计算机图像信号采集与分析系统进行图像分析并计算皮瓣成活率。皮瓣成活率(%)=皮瓣成活面积/皮瓣总面积×100%。(2)生化指标:将冰冻保存的皮瓣组织标本(共120组)匀浆,离心后取上清液,按照丙二醛检测试剂盒、超氧化物歧化酶检测试剂盒说明书检测。(3)血液流变学:各亚组大鼠抽得的血液标本(共120组)置于北京中勤世帝LG-R-80A血液黏度仪上,立即检测全血高切、中切、低切黏度、血浆黏度和红细胞聚集指数等指标。
2 结果
2.1 皮瓣成活率 SO组:大鼠皮瓣全部成活:皮瓣状态与周围皮肤组织相同,颜色红润,弹性良好,未见水肿。IR组:较多数量皮瓣出现坏死:颜色呈黑色或灰黑色,质地变硬失去弹性,有痂壳形成;个别局部有溃烂或渗出,部分皮瓣下方有血肿形成。PNS组:皮瓣存活情况与SO组相似,少量皮瓣虽出现坏死,但坏死面积明显小于IR组;部分皮瓣仅表现为在远端颜色较为发暗,弹性稍差,毛发再生不良,或可见散在结痂创面,其下有少量渗出液,无明显水肿、血肿。
皮瓣成活率:如表1所示,与SO组相比,IR组大鼠皮瓣成活率明显较低,统计学上存在显著性差异(P<0.01);PNS组皮瓣成活率较SO组为低(P<0.01),而与IR组相比,PNS组大鼠皮瓣成活率明显较高,存在显著性差异(P<0.01)。
表1 术后7 d三组大鼠皮瓣成活率比较
注:与SO组相比,*P<0.01;与IR组相比,**P<0.01
2.2 生化指标 (1)MDA:SO组在5个时点皮瓣组织中的MDA值均保持在较低水平,而IR组和PNS组只在T1和T2时点(即再灌注前)的MDA值保持较低水平,与SO组比较差异无统计学意义(P>0.05);IR组和PNS组在皮瓣组织再灌注以后(即血管吻合成功后)的T3~5时点MDA值逐渐升高,与SO组在同一时点比较差异有统计学(P<0.05);PNS组MDA值升高的幅度不如IR组明显,与IR组在同一时点比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。(2)SOD:SO组在5个时点皮瓣组织中的SOD活力均保持在较高水平,而IR组和PNS组只在T1和T2时点的SOD活力保持较高水平,与SO组比较差异无统计学意义(P>0.05);IR组和PNS组在再灌注以后的T3~5时点,SOD活力逐渐降低,与SO组在同一时点比较差异有统计学意义(P<0.05);PNS组SOD活力降低的幅度不如IR组明显,与IR组在同一时点比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表2 三组大鼠皮瓣不同时间点MDA含量的比较
注:与SO组相比,*P<0.05;与IR组相比,**P<0.05
表3 三组大鼠皮瓣不同时间点SOD活力的比较
注:与SO组相比,*P<0.05;与IR组相比,**P<0.05
2.3 血液流变学 SO组大鼠在5个时点血液流变学各项指标基本没有变化,而IR组和PNS组只在T1和T2时点各项指标值与SO组比较差异无统计学意义(P>0.05),而在再灌注以后的T3~5时点各指标值明显升高,与SO组在同一时点比较差异有统计学意义(P<0.05);PNS组各指标值升高的幅度不如IR组明显,与IR组在同一时点比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。
3 讨论
小血管吻合游离皮瓣移植手术的开展,使病灶部位大面积缺损后施行立即修复成为可能。但吻合血管的游离皮瓣是缺血性组织,在从血管离断到吻合完成之后血管再通,会人为地造成微血管循环障碍和缺血再灌注损伤。其中包括皮瓣的缺血与血管痉挛、白细胞介导的感染、血小板聚集及内皮细胞损伤引起的血栓形成和氧自由基的释放导致的氧化应激损伤等[5]。而血液供应量减少及静脉回流障碍是导致皮瓣缺血坏死和缺血再灌注损伤主要原因,血液循环的重建是皮瓣成活的基础[6],因此,改善皮瓣微循环、增加皮瓣的血运、防止皮瓣的再灌注损伤是提高皮瓣成活率的努力方向。本研究建立了大鼠腹部游离皮瓣模型,在实验设计上选取了特定5个时间点进行分组,其中T1(切断股动静脉前)可以认为相当于临床手术过程中游离皮瓣断蒂前、T2(血管吻合成功即刻)则可以认为相当于临床手术过程中皮瓣血管吻合后组织再灌注即将开始,T3~5可认为是游离皮瓣发生缺血再灌注损伤的阶段,在这5个时间点进行标本取材,可以动态观察皮瓣的病理生理变化,以期更好地将实验结果与临床实际结合起来分析。
表4 三组大鼠不同时间点血液流变学指标的比较
注:与SO组相比,*P<0.05;与IR组相比,**P<0.05
既往研究已证实三七总皂苷能改善血液流变学,抑制血小板及红细胞聚集,降低血液黏稠度,扩张微细血管,改善微循环,对抗氧化应激反应,以防止生物膜损伤及钙超载引起细胞损伤[7-9]。三七总皂苷对氧自由基有清除作用,在组织缺血再灌注损伤后,能显著减少缺血区组织的脂质过氧化物MDA,提高SOD活性,并能预防性对抗过氧化氢和超氧阴离子引起的氧化性损伤,减轻氧化应激反应对缺血、缺氧组织的损害,因此,对缺血的皮瓣组织具有保护作用[10]。
组织缺血过程中氧自由基产生过多或抗氧化系统活性下降,可引发脂质过氧化反应损伤细胞膜,使细胞受损[11]。氧自由基与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应,形成脂质过氧化产物MDA,能反映机体脂质过氧化水平,其含量可间接反映机体细胞受自由基攻击的程度[12]。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用,它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害,并及时修复受损细胞,复原因自由基造成的对细胞伤害。此酶能清除超氧阴离子自由基(O·),保护细胞免受损伤,SOD活力的高低可间接反映机体清除自由基的能力[13]。本研究结果显示,皮瓣缺血再灌注后IR组MDA含量随时间延长逐渐增高,SOD的活性逐渐降低,说明氧自由基在皮瓣内蓄积,并导致膜脂质的过氧化和SOD的消耗。而在腹腔注射三七总皂苷后,PNS组MDA含量较IR组降低而SOD的活性明显提高,说明三七总皂苷具有清除氧自由基,减轻氧化应激损伤的作用。与生化检测结果类似,缺血再灌注后,IR组血液流变学各项指标值随时间延长逐渐增高,说明皮瓣组织血管内血液黏度增加、血细胞聚集,从而导致微循环、微血管血流减缓或停滞,有加重微循环障碍的趋势;而在腹腔注射了三七总皂苷的PNS组,其各项指标值随时间延长虽然也逐渐增高,但升高的幅度明显低于IR组,说明三七总皂苷具有调整血液流变学异常、降低血流阻力、减少血栓形成风险的作用。从最终三组大鼠皮瓣成活率的结果上来看,三七总皂苷干预组的皮瓣成活率明显比缺血再灌注组要高,因此,可以推测三七总皂苷可能通过改善微循环,减轻氧化损伤导致的再灌注损伤,促进皮瓣移植后的成活。但由于皮瓣缺血、缺氧性损伤的机制比较复杂,目前的实验结果尚不能排除其他可能的保护机制,需要进一步深入研究三七总皂苷对组织中抗氧化能力和血液流变性是如何发挥调节作用的。综上所述,三七总皂苷对大鼠移植后的游离皮瓣具有保护作用,为其临床应用于提高皮瓣存活率提供了一定的理论依据。
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Effects of panax notoginseng saponins on survival of free abdominal skin flap in rats
WANG Zhi1a,ZHI Ke-qian1b*,XU Zhi-peng2,ZHANG Rui-zhi3
(1a.Department of Anesthesiology,1b.Department of Oncological Head and Neck Surgery,Stomatology Hospital of Xi′an Jiaotong University,College of Medicine,Xi′an 710004,China;2 Department of Stomatology ,The People′s Hospital of Shanxi Province,Xi′an 710068,China;3.Department of Stomatology,Ankang Central Hospital,Ankang 725000,China)
Objective To investigate the effects of panax notoginseng saponins (PNS) on hemorrheology and oxidative stress in rats,and to explore the protective effects and mechanism of PNS on survival of free abdominal skin flap.Methods 144 male SD rats were classified into sham operation group (SO group),ischemia/reperfusion group (IR group) and PNS intervening group (PNS group) at random.To establish the models of free skin flap in rat right abdomen.30 min before surgery,rats were intraperitoneal injected PNS for PNS group and saline for SO and IR group.The level of malonyldialdehyde (MDA) and the superoxide dismutase (SOD) activity were compared between these groups,and the survival rate of flap was observed using image analysis.Results The expression of MDA in IR and PNS group was higher than that in the SO group at 4,8,24 hours after reperfusion,especially in the IR group (P<0.05).The activity of SOD and hemorrheology in IR and PNS group was lower than that in the SO group at 4,8,24 hours after reperfusion,especially in the IR group (P<0.05).The survival rate of flap was:IR group Free skin flap;Oxidative stress;Hemorrheology;Panax notoginseng saponins 2013-12-26 1.西安交通大学口腔医院a.麻醉科,b.头颈肿瘤外科,西安710004;2陕西省人民医院口腔科,西安710068;3安康市中心医院口腔科,安康 725000 国家自然科学基金资助项目(81272957);西安市科技计划项目(SF1023) *通信作者