山奈酚对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

童方念，罗 超，罗丹，吴艺芳，骆明旭，王汉琴，孙设宗，王 珏，朱名安，赵万红

(湖北医药学院1.药护学院；2.基础医学院，湖北十堰 442000)

◇基础研究◇

山奈酚对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

童方念1，罗 超2，罗丹1，吴艺芳1，骆明旭1，王汉琴2，孙设宗2，王 珏2，朱名安2，赵万红2

(湖北医药学院1.药护学院；2.基础医学院，湖北十堰 442000)

目的 研究山奈酚对四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法 昆明种雄性小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(水飞蓟宾组)和低、高剂量山奈酚组。前2组给予溶剂蒸馏水灌胃，其余组分别给予0.1 g/(kg·d)水飞蓟宾或6 mg/(kg·d)、18 mg/(kg·d)山奈酚，连续7 d。末次灌胃2 h后，空白对照组腹腔注射花生油，其余各组腹腔注射1.5 mL/L CCl4花生油混合液，制备急性肝损伤模型。测定并比较各组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，肝组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量或活力及肝脏病理学变化的差异。结果 与模型组比较，山奈酚低、高剂量均可明显降低小鼠血清ALT和AST含量(P<0.05或P<0.01)，降低肝组织MDA含量(P<0.01)，增加SOD活力(P<0.05或P<0.01)，水飞蓟宾对上述指标有相似作用(P<0.05或P<0.01)。病理切片显示，与模型组比较，水飞蓟宾组和低、高剂量山奈酚组的肝细胞坏死范围及程度均明显减少，炎细胞浸润程度明显减轻，其中高剂量山奈酚组的效果最好。结论 山奈酚对CCl4致小鼠急性肝损伤有保护作用，其机制可能是山奈酚减少自由基的生成。

山奈酚；肝损伤；四氯化碳；自由基；谷丙转氨酶；谷草转氨酶；丙二醛；超氧化物歧化酶

山奈酚(kaempferol)又名山柰素、山柰黄酮醇、四羟基黄酮、百蕊草素，属于黄酮类黄酮醇亚属，分子式为C15H10O6，相对分子量为286.23。山奈酚主要来源于姜科植物山奈的根茎，并广泛存在于各种植物的花、叶和果实中，现已从茶叶、椰菜、蜂胶、柚子及其他绿色植物中提取到它的单体[1]。因山奈酚具有抗炎、抗氧化、防癌等多种功效，可用于癌症、心血管疾病、抗微生物感染等疾病的治疗而受到人们广泛关注[2]，但有关其对化学性肝损伤保护作用的研究未见报道。从传统中草药有效成分中发现新药是现代药学研究的热点。本研究旨在观察山奈酚对四氯化碳(CCl4)致急性肝损伤的保护作用及其可能机制，为增加山奈酚的临床适应症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级昆明种雄性小鼠40只，体质量20～22 g，由湖北医药学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)20011-0008。动物置于室温(22±1)℃，相对湿度65%及正常昼夜节律调节光照时间环境下，食用标准饲料，自由饮水，处死12 h前禁食不禁水。

1.2 药物、试剂及仪器 山奈酚(纯度97%)和水飞蓟宾(纯度98%)均购自十堰市四维生物科技有限公司，谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和考马斯亮蓝试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其余试剂均为国产分析纯。ZS83-1型内切式组织匀浆机(浙西机械厂)、722S可见分光光度计(上海第二光学仪器厂)、SH/YF-9光学显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)、HH.S21-8电热恒温水浴锅(上海博迅有限公司)、Konelab 60i全自动生化分析仪(芬兰Konelab公司)。

1.3 小鼠CCl4肝损伤模型制备与分组 适应性饲养小鼠1周后随机分5组：空白对照组、模型组、阳性对照组(水飞蓟宾组)和低、高剂量山奈酚组。空白对照组和模型组均给予溶剂20 mL/kg蒸馏水，其余组分别给予0.1 g/kg水飞蓟宾或6 mg/kg、18 mg/kg山奈酚，每天灌胃1次，连续7 d，实验期间小鼠自由进食与饮水。末次灌胃2 h后，空白对照组腹腔注射花生油10 mL/kg，其余各组均按10 mL/kg体重腹腔注射1.5 mL/L CCl4花生油混合液。末次给药8 h后小鼠禁食不禁水。20 h后摘取小鼠眼球取血，分离血清，颈椎脱臼处死小鼠并取肝脏。

1.4 检测指标 小鼠眼球取血后，制备血清，用全自动生化分析仪测量其ALT、AST含量。

采集肝脏左小叶约0.4 g，用生理盐水冲洗数次，用滤纸拭干后精确称重，按质量体积比1∶9加入4 ℃ 生理盐水，在冰浴中制备组织匀浆，4 000 r/min离心5 min。取上清液4 ℃储存备用。测定各组肝组织匀浆中蛋白质含量，用冰生理盐水稀释成4 mg/mL蛋白，按试剂盒说明测肝组织SOD和MDA活力和含量。

摘取肝右叶，置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定48 h，石蜡包埋切片，厚度约4 μm，常规Hematoxy-Eosin(HE)染色，于光镜下观察肝脏组织病理变化。

2 结 果

2.1 山奈酚对小鼠血清ALT、AST的影响 与对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST含量明显升高(P<0.01)，提示CCl4肝损伤模型制备成功。与模型组比较，水飞蓟宾组血清ALT和AST含量降低(P<0.05或P<0.01)，低、高剂量山奈酚组小鼠血清ALT、AST均显著降低(P<0.05或P<0.01)，且山奈酚作用呈剂量依赖性。与水飞蓟宾组比较，高剂量山奈酚组降低ALT作用效果更好(P<0.01，表1)。可见，水飞蓟宾和山奈酚对小鼠CCl4肝损伤有显著的保护作用。

2.2 山奈酚对小鼠肝脏SOD、MDA的影响 与对照组比较，模型组小鼠肝脏SOD活力显著降低(P<0.01)，MDA含量显著升高(P<0.01)，提示造模成功。与模型组比较，水飞蓟宾组小鼠肝脏SOD活力显著升高(P<0.05)，MDA水平显著降低(P<0.01)，低、高剂量山奈酚组小鼠肝脏SOD活力显著升高，而MDA含量显著降低(P<0.01，表2)。可见，山奈酚可对抗小鼠CCl4肝损伤致SOD活力降低和MDA含量的增加。

表1 山奈酚对CCl4致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST的影响

Tab.1 Effects of kaempferol on the activities of serum ALT and AST in mice with acute liver injury induced by CCl4(±s , n=8)

与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 山奈酚对小鼠肝组织病理学的影响 光镜下观察，可见空白对照组肝细胞形态完整，排列整齐，无明显异常。模型组可见肝小叶中肝细胞呈大片灶状坏死，中央静脉和汇管区有较多炎性细胞浸润，与对照组比较有明显差异，说明制备CCl4肝损伤模型成功。水飞蓟宾组肝细胞大致正常，于汇管区有少量坏死及少量炎细胞浸润，与模型组比较，肝细胞损伤有所减轻。低剂量山奈酚组肝细胞以中央静脉为中心呈现点状坏死，汇管区有炎细胞浸润。高剂量山奈酚组肝细胞形态、分布基本正常，中央静脉周边有少数散在坏死，汇管区有散在的炎细胞浸润，且肝细胞损伤数量、范围、程度与低剂量组、水飞蓟宾组比较明显减轻。与模型组比较，低、高剂量组肝细胞损伤明显减轻(图1)。提示水飞蓟宾及低、高剂量山奈酚对CCl4致急性肝损伤均有明显保护作用。

表2 山奈酚对CCl4致小鼠急性肝损伤肝组织SOD、MDA的影响

Tab.2 Effects of kaempferol on the activities of liver SOD and MDA in mice with acute liver injury induced by CCl4(±s , n=8)

与对照组比较，**P< 0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

图1 山奈酚对小鼠肝组织病理学的影响
Fig.1 Effects of kaempferol on liver histopathology of mice with acute liver injury induced by CCl4(HE, ×400)
A：对照组；B：模型组；C：水飞蓟宾组；D：6 mg/kg山奈酚组；E：18 mg/kg山奈酚组。

3 讨 论

CCl4肝损伤模型是研究肝损伤的经典模型，常用于研究保肝、护肝药物的药效及其作用机制[3-4]。目前认为CCl4引起肝损伤的机制是：CC14在肝微粒体细胞色素P450催化下生成三氯甲烷自由基(·CCl3)和过氧化三氯甲基(·CCl3OO)等自由基及大量活性氧产物，这些物质可结合细胞内大分子物质并攻击肝细胞膜，引起一系列脂质过氧化反应，使肝细胞发生变性、坏死、酶渗漏等。肝细胞中存在多种化学酶，肝细胞受损后ALT和AST从肝细胞质和线粒体中释放出来，使血清中含量增加[5-6]。因此，血清中ALT和AST含量可反映肝细胞损伤程度。研究结果显示，山奈酚组与模型组相比，ALT和AST明显降低，表明山奈酚能够对抗CCl4引起的肝细胞损伤，且其作用具有浓度依赖性。

MDA是体内脂质过氧化反应终产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、坏死，其含量的改变反映自由基损伤引发的脂质过氧化情况[7]。研究结果显示，模型组肝细胞MDA含量明显高于对照组，说明肝细胞发生明显的脂质过氧化反应。山奈酚组与模型组相比，肝组织中MDA明显降低，表明山奈酚具有减少自由基生成，减轻肝细胞损伤的作用。SOD是体内主要的抗氧化酶，属于金属蛋白酶，能够清除体内氧自由基，保护组织细胞免受自由基的攻击。其水平高低间接反映机体清除自由基的能力，其水平的变化又间接反映机体氧自由基含量的变化[8]。与模型组比较，山奈酚组使SOD活性增加，表明其具有清除自由基，进而减轻肝细胞氧化损伤的作用。病理组织学显示，山奈酚可明显减轻肝细胞变性、坏死程度及损伤范围，减轻炎细胞浸润。其对肝组织形态的改善与生化指标一致，进一步证实了山奈酚对CCl4所致肝损伤有保护作用。

文献报道含酚羟基的化合物具有明显的清除氧自由基作用，其作用可能与所带酚羟基数目有关[9]。山萘酚又称3，4′，5，7-四羟基黄酮，其4个羟基均可与活性自由基相结合。这可能正是山奈酚减轻氧化性肝损伤的机制。还有文献报道黄酮类化合物对各种实验性肝损伤均有不同的保护作用，其作用与其清除自由基、抗脂质过氧化、调节免疫功能等有关[10]。由此推断，黄酮类物质山奈酚正是通过减少自由基生成，减轻氧化损伤，进而发挥了对抗CCl4所致肝损伤的作用。

另外，阳性药水飞蓟宾是水飞蓟素中具有生物活性的主要成分，是经典的肝损伤修复药物，有明显的保护和稳定肝细胞膜的作用，本研究结果与文献报道一致[11]。而山奈酚也具有良好的肝保护作用，有望成为治疗肝病的药物。

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(编辑 国 荣)

Protective effects of kaempferol on CCl4-induced acute liver injury in mice

TONG Fang-nian1, LUO Chao2, LUO Dan1, WU Yi-fang1, LUO Ming-xu1,WANG Han-qin2, SUN She-zong2, WANG Jue2, ZHU Ming-an2, ZHAO Wan-hong2

(1. Institute of Medicine and Nursing; 2. Faculty of Basic Medical Sciences,Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China)

Objective To study the protective effects and mechanism of kaempferol on carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver injury in mice. Methods Kunming male mice were randomly divided into blank control group, model group, positive control group, and low- and large-dose kaempferol groups. The first two groups were given distilled water and the other groups were given silybin at 0.1 g/kg body weight/d, and kaempferol at 6 and 18 mg/kg body weight/d for 7 consecutive days, respectively. The blank control group was intraperitoneally injected with peanut oil, and the other groups were intraperitoneally given 0.15% CCl4peanut oil solution at 2 h after the last administration in order to prepare acute liver injury mice models. The levels of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), and malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in liver tissue in all groups were determined and compared. Meanwhile, liver histopathology was investigated. Results Compared with model group, kaempferol could significantly decrease ALT and AST activities in the mice serum (P<0.05 orP<0.01) and MDA in the liver tissue (P<0.01), and increase the activity of SOD in liver tissue (P<0.05 orP<0.01). Silybin had the similar actions. The pathologic examination showed that compared with those in model group, the range and degree of liver cell necrosis and inflammatory cell infiltration in silybin and kaempferol groups were significantly reduced, with high-dose kaempferol group having the strongest effects. Conclusion Kaempferol has a protective effect on CCl4-induced acute liver injury in mice. The mechanisms may be related to reducing the generation of free radicals.

kaempferol; liver injury; CCl4; free radical; alanine aminotransferase (ALT); aspartate aminotransferase (AST); malondialdehyde (MDA); superoxide dismutase (SOD)

2014-03-02

2014-06-16

国家自然科学基金资助项目(No.81341138)；湖北省2011协同创新中心基金 (No.4)；湖北省高等学校2013年大学生创新创业训练计划项目(No.201313249006) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81341138), the Fund of Hubei 2011 Cooperative Innovation Center (No.4), and 2013 Undergraduate Students Innovation and Entrepreneurship Training Plans of Hubei Province (No.201313249006)

赵万红，博士，副教授.E-mail: zwanhong@sohu.com

童方念(1991-)，女(汉族)，研究生，主要从事生化药理学研究. E-mail: 526644768@qq.com

时间：2014-09-16 11∶25 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140916.1125.002.html

R575.1

A

10.7652/jdyxb201406017