肥大细胞干细胞因子在人慢性根尖周病中的表达*

靳 华， 施庆颜， 梁经文， 黄世光△

(1武警广东省总队医院口腔科，广东 广州 510507； 2暨南大学医学院口腔医学系，广东 广州 510632)

肥大细胞干细胞因子在人慢性根尖周病中的表达*

靳 华1▲， 施庆颜2▲， 梁经文2， 黄世光2△

(1武警广东省总队医院口腔科，广东 广州 510507；2暨南大学医学院口腔医学系，广东 广州 510632)

目的： 观察干细胞因子(stem cell factor，SCF)在慢性根尖周病患者肥大细胞(mast cells，MCs)中的表达情况，探讨SCF阳性MCs在根尖周病发病机制及根尖周纤维组织的形成，尤其在根尖周囊肿纤维组织形成中的作用。方法: 选择2011年7月～2013年6月期间在暨南大学荔湾口腔教学医院临床诊断为根尖囊肿或根尖肉芽肿并接受根尖刮治手术的病例30例，其中根尖肉芽肿15例，根尖囊肿15例。正常对照组20例，取自因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙。标本经10%甲醛固定48 h以上。组织标本经石蜡包埋、组织连续切片，HE染色，光学显微镜下观察其组织学改变；采用免疫组织化学法，观察各组标本组织中MCs数目及MCs脱颗粒情况；采用免疫荧光双染色法，在荧光显微镜下观察各组标本组织中tryptase-SCF双阳性MCs数目。结果: 免疫组织化学染色结果显示，2组慢性根尖周病组织中MCs和脱颗粒MCs数量与正常对照组相比显著增多(P<0.01)；根尖囊肿组的MCs和脱颗粒MCs的数量均明显高于根尖肉芽肿组(P<0.05)。免疫荧光双染色结果显示，2组慢性根尖周病组织中的tryptase-SCF双阳性MCs密度与正常对照组相比显著增多(P<0.01)；根尖囊肿组tryptase-SCF双阳性MCs密度明显高于根尖肉芽肿组(P<0.05)。各组标本组织中免疫组织化学染色MCs密度与免疫荧光双染色MCs密度无显著差异(P>0.05)。结论: Tryptase-SCF双阳性肥大细胞在慢性根尖周病的炎症损害，尤其在根尖囊肿的纤维组织形成中发挥重要作用。Tryptase-SCF双阳性肥大细胞与慢性根尖周病炎症损害的发生、进展及其持续存在有关。

慢性根尖周病； 肥大细胞； 类胰蛋白酶; 干细胞因子

根尖周疾病是宿主防御感染根管内微生物的炎症反应过程，导致根尖周组织的炎症和骨质吸收破坏[1]。在人类，肥大细胞(mast cells，MCs)有2个亚型，根据类胰蛋白酶(tryptase)和类糜蛋白酶(chymase)的表达差异，分为结缔组织型肥大细胞(connective tissue mast cell, CTMC)和黏膜型肥大细胞(mucosal mast cell, MMC)，其中CTMC含类胰蛋白酶、类糜蛋白酶、MC羧基肽酶(mast cell carboxypeptidase，MC-CP)和组织蛋白酶G(cathepsin G，CG)。CTMC既含有类胰蛋白酶又含有类糜蛋白酶，而MMC只含类胰蛋白酶，不含类糜蛋白酶[2]。研究显示干细胞因子(stem cell factor，SCF)作用于MCs，诱导MCs的存活、增殖和分化[3]。SCF/c-Kit信号与炎症反应、过敏性哮喘以及纤维化等疾病均有密切关系。我们前期研究已经表明肥大细胞的募集和脱颗粒[4]、肥大细胞Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白1(T-cell immunoglobulin mucin 1，TIM-1)和TIM-3与牙周病及其炎症程度密切相关[5-7]，提示肥大细胞在牙周病的发病及病理过程中起重要作用。尽管进行了大量的实验及临床研究，有关MCs的SCF参与根尖周病的致病机制尚未见报道。本文采用免疫组织化学染色法，观察各组根尖周病组织标本中MCs形态及脱颗粒情况并计数；采用免疫荧光双染色法观察各组标本组织中tryptase-SCF双阳性肥大细胞的表达，探讨SCF阳性MCs在根尖周病发病机制、根尖周纤维组织的形成，尤其在根尖周囊肿纤维组织形成中的作用。

材 料 和 方 法

1 研究对象

1.1 病例选择 选择2011年7月～2013年6月期间在暨南大学荔湾口腔教学医院临床诊断为根尖囊肿或根尖肉芽肿并接受根尖刮治手术并经病理检查确诊的病例30例，其中根尖肉芽肿15例(24～62岁)，根尖囊肿15例(23～60岁)。正常对照组20例(年龄16～22岁)为正常牙周膜，来自2013年6月～9月期间因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，所有这些前磨牙牙根发育完全并且没有根尖周病。所有患者均没有系统性疾病而且至少两个月前停止使用抗生素。样本收集之前取得患者的书面知情同意书。

1.2 分组及取材 正常对照组为因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙牙周膜，共20例；根尖肉芽肿组为X线显示患牙根尖周有圆形或椭圆形的密度降低区，直径<1 cm，边界清楚，组织学检查见明显的炎症细胞浸润，并无鳞状上皮衬里，共15例；根尖囊肿组为X线显示患牙根尖周有圆形或椭圆形的密度降低区，直径>1 cm，边界清楚,有白色阻射线包绕，组织学检查见根尖区组织存在部分或全部上皮覆盖，囊肿表现为完整的囊腔，囊腔为一定厚度的复层鳞状上皮覆盖。上皮层可见明显炎症细胞浸润，纤维组织层以胶原纤维为主，未见明显的炎症细胞浸润，共15例。

2 实验方法

2.1 组织标本采集、处理与观察 根尖肉芽肿和根尖囊肿标本是在进行根尖刮治手术时取得的根尖周病变组织。正常对照组标本取自因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，用无菌刀片将牙周膜从牙根上刮取。样本立即固定于10%甲醛溶液中48 h以上，经脱水、透明、浸蜡、包埋，制备成5 μm厚度组织连续切片。由2名病理医师盲法观察各组标本的组织学改变。

2.2 MCs免疫组织化学染色与观察 抗tryptase I抗(Abcam)，稀释浓度为1∶200；兔二步法试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司)。组织切片通过常规脱蜡、乙醇复水，柠檬酸盐缓冲液微波修复、山羊血清封闭、I抗孵育过夜、II抗孵育DAB显色后用中性树胶封片。免疫组织化学染色阳性信号为棕黄色或黑褐色细小颗粒，定位于细胞核和/或细胞浆。2名病理医师于光学显微镜下观察组织切片中MCs形态及脱颗粒情况并计数。在高倍视野下(×400)对每张切片中全部MCs计数，并记录每张切片的组织面积大小。计算各组MCs及脱颗粒MCs密度。MCs密度=每张切片中MCs总数/每张切片的组织面积(mm2)；脱颗粒MCs密度=每张切片中脱颗粒MCs总数/每张切片的组织面积(mm2)。

2.3 Tryptase-SCF双阳性MCs免疫荧光双染色 抗tryptase I抗，稀释浓度为1∶200；抗SCF I抗(Santa Cruz)稀释浓度为1∶100；山羊抗鼠IgG Alex Flour 555®及山羊抗兔IgG Alex Flour 488®(Cell Signaling)稀释浓度为1∶200。组织切片通过常规脱蜡、乙醇复水，柠檬酸盐缓冲液微波修复、山羊血清封闭，I抗孵育，避光条件下II抗孵育,荧光染色后采用抗荧光淬灭封片液封片，立即在荧光显微镜下观察。2名病理医师于免疫荧光显微镜下观察到MCs均表达有SCF，从而对各组实验标本中tryptase-SCF双阳性MCs计数并计算各组tryptase-SCF双阳性MCs密度。在高倍视野下(×400)对每张切片的tryptase-SCF双阳性MCs计数，并记录每张切片的组织面积大小。tryptase-SCF双阳性MCs密度=每张切片中tryptase-SCF双阳性MCs总数/每张切片的组织面积(mm2)。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0统计软件进行分析。不同组间MCs密度及tryptase-SCF双阳性MCs密度的比较采用Kruskal-Wallis 检验；3组之间存在差别则进行3个独立样本Nemenyi法检验两两比较。不同组间免疫组织化学染色法和免疫荧光双染色法MCs密度的比较采用Wilcoxon符号秩检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 组织学观察

正常对照组未见明显炎症细胞浸润(图1A)；根尖肉芽肿组可见大量炎症细胞浸润，主要为单核细胞、淋巴细胞和浆细胞呈灶性浸润，其中巨噬细胞样细胞和中性粒细胞呈散在浸润(图1B)；根尖囊肿组的上皮层表现为细胞间水肿，上皮下见大量以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润(图1C)；纤维组织层以胶原纤维为主，未见明显的炎症细胞浸润(图1D)。

2 MCs免疫组织化学染色

正常对照组的健康牙周膜组织中可见正常寄居的MCs，数量极少(图2A)。根尖肉芽肿组与正常对照组相比，MCs的数量有所增加，MCs呈圆形或卵圆形，细胞边缘整齐光滑，胞质颗粒均匀，部分MCs呈轻度～中度脱颗粒(图2B)。根尖囊肿组可见大量MCs定位于囊性上皮稍下方、结缔组织和上皮内区域，染色较深，形态多样，MCs呈明显脱颗粒现象，部分MCs崩解，异染性颗粒散落在细胞外(图2C)。

Figure 1.Histology of the specimens (HE staining,×400).A: healthy control; B: periapical granuloma; C: the epithelial layer of periapical cyst; D: the fibrous tissue area of periapical cyst.

图1 各组标本的组织学观察

Figure 2.Representative photomicrographs of MCs infiltration with tryptase immunohistochemiscal staining (×1000). A: healthy control; B: periapical granuloma; C: periapical cyst.

图2 各组标本MCs的免疫组织化学染色观察

各组标本组织中MCs及脱颗粒MCs密度比较见图3。与正常对照组相比，2组慢性根尖周病组织中MCs密度及脱颗粒MCs密度显著上升(P<0.01)，且根尖囊肿组的MCs密度及脱颗粒MCs密度明显高于根尖肉芽肿组(P<0.05)。

3 Tryptase-SCF双阳性MCs免疫荧光双染色结果

各组标本组织中MCs均表达有SCF。正常对照组健康牙周膜组织中仅可见少量散在分布的tryptase-SCF双阳性MCs；根尖肉芽肿组根尖周病变组织中tryptase-SCF双阳性MCs数目明显增多；根尖囊肿组根尖周病变组织囊性上皮稍下方、结缔组织和上皮内tryptase-SCF双阳性MCs数目显著增多。见图4。

Figure 3.Density of MCs and degranulated MCs.Mean±SD.**P<0.01vshealthy control;△P<0.05vsperiapical granuloma.图3 各组标本组织中MCs及脱颗粒MCs的密度

Figure 4.Representative photomicrographs of MCs infiltration with tryptase-SCF immunofluorescence double staining (×1 000).

图4 各组标本组织中的tryptase-SCF阳性MCs

3组标本组织中tryptase-SCF双阳性MCs密度均不同(P<0.01)，其中根尖囊肿组tryptase-SCF双阳性MCs密度最高。Nemenyi检验分析结果显示：正常对照组与根尖肉芽肿组及根尖囊肿组tryptase-SCF双阳性MCs密度之间存在显著差异(P<0.01)；根尖囊肿组tryptase-SCF双阳性MCs密度明显高于根尖肉芽肿组(P<0.05),见图5。

Figure 5.Density of tryptase-SCF positive MCs.Mean±SD.**P<0.01vshealthy control;△P<0.05vsperiapical granuloma.

图5 各组标本组织中tryptase-SCF双阳性MCs的密度

4 免疫组织化学染色与免疫荧光双染色MCs密度的比较

免疫组织化学染色结果中MCs密度与免疫荧光双染色结果中MCs密度之间无显著差异(P>0.05)，见图6。

Figure 6.The comparison of immunohistochemistry staining (IHC) and double immunofluorescence staining (IF).Mean±SD.

图6 各组标本免疫组织化学染色与免疫荧光双染色MCs的密度比较

讨 论

根尖周疾病的发生、发展及转归与根尖周组织的免疫应答密切相关[8]，MCs和巨噬细胞是根尖周病炎症浸润的重要组成部分[9]，且表达多种细胞因子、趋化因子和受体，被认为是根尖周感染免疫应答的重要参与者。其中，一些细胞因子参与炎症、组织修复及与根尖囊肿相关的骨吸收机制[10]。近年来研究发现MCs是重要的免疫调节性和效应细胞，在固有免疫和适应性免疫反应中均有重要作用[2]。研究显示SCF作用于早期造血干细胞、原始造血祖细胞、MCs和黑色素细胞，诱导这些细胞存活、增殖和分化；SCF/c-Kit信号与炎症反应、过敏性哮喘以及肝组织纤维化等疾病均有密切关系。

研究显示根尖周病变区MCs的数量不多，主要集中于肉芽组织与纤维组织的移形过渡区和血管周围[11]。Drazic等[12]观察到根尖周病中脱颗粒的MCs与成纤维细胞相邻，提示MCs可能在纤维组织形成中发挥重要作用。研究表明，根尖囊肿中MCs的细胞密度高于根尖周肉芽肿，MCs脱颗粒释放的tryptase和前列腺素参与囊肿-骨接触区的骨吸收，促进囊肿扩张[13]；在富含炎症细胞的组织区域和囊肿上皮的下方均可检测到MCs存在，同时位于牙槽骨边界的MCs出现脱颗粒现象，表明MCs在早期骨破坏区处于高度激活状态并能够释放tryptase，提示MCs及其tryptase可能在颌骨囊肿组织的增长中起到改建作用，同时破坏周围骨组织，最终导致颌骨囊肿扩张[14]。本研究中我们采用免疫组织化学染色法对15例根尖肉芽肿、15例根尖囊肿和20例正常牙周膜进行检测,结果显示：2组慢性根尖周病组织中MCs和脱颗粒MCs数量较正常对照组明显增多，且根尖囊肿组MCs和脱颗粒MCs数量均明显高于根尖肉芽肿。我们的研究结果与多数研究者的结果一致，提示MCs参与根尖周病变过程。

SCF又称肥大细胞生长因子(mast cell growth factor，MGF)、青灰因子(steel factor，SF)、原癌基因c-kit酪氨酸激酶受体配体(c-kitligand，KL)，是多能干细胞生长因子，SCF主要作用于早期造血干细胞、原始造血祖细胞、MCs和黑色素细胞，诱导这些细胞存活、增殖和分化[5]。体外实验发现SCF可以由多种细胞(包括结构细胞和炎症细胞)产生，其中结构细胞主要有成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，炎症细胞主要有MCs和嗜酸性粒细胞[15]。

SCF及其受体c-Kit都能在MCs及嗜酸性粒细胞表面检测到，在促炎细胞因子刺激下，SCF表达增加；另一方面，糖皮质激素可下调SCF在人肺成纤维细胞上的表达[16]，表明SCF可能影响炎症细胞的功能。SCF是人MCs生长和分化的主要因子，可以抑制MCs凋亡维持其存活[17]；在炎症病理状态下，SCF在MCs的活化、黏附和趋化作用中发挥关键作用[18]。SCF不仅能够直接诱导MCs脱颗粒，还能通过加强抗原刺激诱导MCs脱颗粒，释放组胺等，促发MCs介导的炎症反应[19]。在慢性创伤及牛皮癣患者的组织中均能检测到SCF和c-Kit强烈表达，促使MCs持续性生长、活化；而在伤口愈合中，MCs有一过性活化，SCF的表达水平在早期急速增长后下降，与一过性活化MCs的表达水平相一致[20]。

尽管进行了大量的实验及临床研究，根尖周病变的免疫调节机制迄今尚未阐明，有关MCs的SCF参与根尖周病的致病机制尚未见报道。Tryptase阳性MCs与SCF相互作用，tryptase阳性MCs在SCF的作用下活化，表达并合成纤维化基因的生物活性因子，提示tryptase-SCF阳性MCs在根尖周病的发病机制，尤其在根尖周囊肿的纤维组织形成中发挥重要作用。因此，本课题我们采用免疫荧光双染色法，观察不同类型慢性根尖周病中MCs的分布、并分析MCs上SCF的表达情况。结果显示：2组慢性根尖周病组织中tryptase-SCF双阳性MCs密度较正常对照组显著增多；根尖囊肿组tryptase-SCF双阳性MCs密度明显高于根尖肉芽肿组。本研究对于阐明SCF阳性MCs在根尖周病的发病机制、根尖周囊肿纤维组织形成中的作用具有理论意义和临床指导价值。控制SCF阳性MCs或调节MCs的功能可能成为阻止根尖周病发展的一个治疗,从而为根尖周病的治疗提供新的靶点，为临床治疗根尖周病提供更有效的治疗方向和途径。

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Expression of stem cell factor in mast cells isolated from patients with chronic periapical diseases

JIN Hua1, SHI Qing-yan2, LIANG Jing-wen2, HUANG Shi-guang2

(1DepartmentofStomatology,ArmedPoliceCorpsHospitalofGuangdong,Guangzhou510507,China;2FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the expression of stem cell factor (SCF) in tryptase -positive mast cells (MCs) in different types of human periapical diseases for determining the role of SCF and MCs in the pathogenesis of periapical diseases. METHODS: A total 50 cases of specimens were involved in this study, including healthy control (n=20), periapical cyst (n=15) and periapical granuloma (n=15). The tissue material was fixed in 10% formalin for at least 48 h, stained with hematoxylin and eosin for the observation of histopathology, stained with immunohistochemistry for identifying MCs and MCs degranulation, and stained with double immunofluorescence for identification of tryptase-SCF double positive MCs. RESULTS: Compared with healthy control, significantly higher densities of both total and degranulated MCs in human periapical lesions were observed. The densities of both total and degranulated MCs in the periapical cyst were significantly higher than that in the periapical granuloma. The density of tryptase-SCF double positive MCs in the periapical lesions was significantly higher than that in the healthy controls. The density oftryptase-SCF double positive MCs in the periapical cyst was significantly higher than that in periapical granuloma. No significant difference in the density of MCs between immunohistochemistry staining and double immunofluorescence staining was observed. CONCLUSION: The tryptase-SCF double positive MCs play an active role in the pathogenesis of the periapical inflammatory lesions, particularly in the formation of fibrous tissue in periapical cyst. The potential role of the tryptase-SCF double positive MCs relates with the initiation, development, and persistence of the periapical inflammatory process.

Chronic periapical disease; Mast cells; Tryptase; Stem cell factor

1000- 4718(2014)12- 2243- 06

2014- 06- 23

2014- 09- 15

广东省医学科研基金资助项目(No．A2013454)

R363； R781

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.022

△通讯作者 Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

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