腹泻腺病毒检验方法临床应用

2014-07-18李满元刘卫东许崇波

中国现代药物应用 2014年6期

李满元刘卫东许崇波

腹泻腺病毒检验方法临床应用

李满元刘卫东许崇波

目的腹泻腺病毒检验方法临床应用。方法免疫层析法对锦州儿童医院及锦州地区腹泻患者进行腺病毒检测, 并对全部阳性标本及100阴性标本采用聚合酶链反应(PCR)方法特异性确认。结果标本632例阳性标本为24例, 阳性率3.79%。PCR阳性结果全部符合, 阴性标本其中1份为阳性。结论免疫层析法检测腺病毒, 具有快速, 特异性高, 操作简便, 对实验室和工作人员条件要求低, 适合基层医院广泛开展。

腺病毒检测方法免疫层析 PCR

腺病(adenovirus, ADV)是引起婴幼儿病毒性腹泻的重要病原体, 腺病毒, 已经确认其可导致呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等多个系统与器官的感染, 临床有一定症状表现［1］。ADV造成腹泻主要是40和41型［2］, 有报道是仅次于轮状病毒腹泻病毒,主要感染两岁以下儿童, 传播途径呼吸道传播, 也有经粪- 口途径或有人与人的接触传播［3］。肠道腺病毒感染高峰期位于5 月～6月和9月～11月［4］。为了解锦州地区腺病毒感染情况, 开展腺病毒免疫层析法检验,并对阳性标本进行聚合酶链反应(PCR)方法进行特异性确认,以期待能在临床广泛应用。特报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料收集锦州市儿童医院2013年1月～2013年6月门诊腹泻患者316例, 年龄4～60个月, 男女不限。按照留取粪便要求留取粪便, 直接接入干净无污染的容器内, 不得在纸尿裤或尿布中刮取。

1.2主要试剂免疫层析法：检测卡, 样品稀释管厂家北京万泰。聚合酶链反应(PCR)方法：DNA 提取液, PCR反应管, DNA浓缩液, ADV强阳性质控品, 阴性质控品。厂家中山大学达安基因股份有限公司。

1.3主要设备离心机, 杭州博日实时荧光定量PCR仪等。

1.4方法

1.4.1免疫层析 ①旋开滴管, 取出采便勺, 从粪便中取一勺粪便, 放入稀释液中, 旋紧滴管。②混匀标本, 折断滴管盖帽。③测试卡平铺在干燥平面。④垂直缓滴2～3滴混匀样品至测试卡加样中心。⑤5～10 min内判断结果, 结果不可以超过10 min。

1.4.2聚合酶链反应(PCR)方法

1.4.2.1标本处理取少量粪便加入1 ml灭菌生理盐水,充分震荡混匀, 挤干棉拭子, 取100 μl上清至1.5 ml离心管中,加入100 μl浓缩液混匀, 12000 rpm离心10 min。

1.4.2.2阴性质控品,阳性质控品处理取阴阳性质控品, 8000 rpm离心数秒, 吸50 μl～0.5 ml灭菌离心管中, 加入50 μl DNA提取液充分混匀, 100℃恒温处理10 min。12000 rpm离心5 min。

1.4.2.3PCR扩增取ADV-PCR反应管若干, 分别加入处理后上清液(含病毒DNA)各2 μl, 8000 rpm离心1 min。将各反应管放入定量PCR仪器的孔样品槽内, 按对应顺序设置阴性质控品、阳性定量质控参考品梯度以及未知标本, 并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件:93℃→2 min预变性,然后按93℃ 45 s→55℃ 60 s,先做10个循环, 最后按93℃ 30 s→55℃ 45 s,做30个循环。所有设置全部完成后保存文件, 最后运行程序。