紫外分光光度法测定乌药中总生物碱含量

张剑等

摘要：用紫外分光光度法测定乌药中的总生物碱含量。先用索氏提取法提取乌药中的总生物碱，再以小檗碱为对照品，在pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，以溴甲酚绿指示液为显色剂，在628 nm波长下利用分光光度法测定乌药中的总生物碱含量。结果表明，小檗碱对照品在2.0～12.0 mg/L范围内呈线性关系，回归方程为D=0.008 2C+0167 1，r=0.999 1，乌药中的总生物碱含量为0.301 4%。本方法操作简便、迅速，测定结果准确、可靠。

关键词：乌药；总生物碱；分光光度法

中图分类号：R284.1；O657.32 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0266-02

乌药[Lindera aggregata （Sims）Kosterm]系樟科（Lauraceae）山胡椒属（Lindera）植物，为传统的理气止痛药[1]，具有温中散寒、理气止痛的功效，最早记载于唐代陈藏器《本草拾遗》。现代药理学研究表明，乌药具有广泛的药理活性[2-3]。乌药根的主要有效成分为异喹啉类生物碱及呋喃倍半萜[4]，其中生物碱和呋喃倍半萜及其内酯类成分是乌药的特征性成分[5-7]，具有较强的专属性，也具有一定的活性。为了确保乌药的质量标准评价有具体的量化指标，根据乌药中所含成分的特点，本研究采用酸性染料比色法测定乌药中的生物碱含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

主要仪器：紫外可见分光光度计（尤尼柯UV-4802）；98-1-C数显控温电热套（天津泰斯特）；索式提取器；电子天平；三氯甲烷（AR）；溴甲酚绿（AR）；小檗碱标准品（成都领航者生物技术有限公司）；pH值45的醋酸-醋酸钠缓冲液；0.01 mol/L氢氧化钠溶液（用乙醇溶解）。

试验所用中药材乌药样品采自江西赣南。

1.2 试验方法

本研究所用试验方法参照文献[8-10]的方法并加以改进。

1.2.1 缓冲液的配制 pH值4.5缓冲液的配制：将 0.2 mol/L 氢氧化钠滴加至冰醋酸中，调节pH值为45，即得醋酸-醋酸钠缓冲溶液。0.04%溴甲酚绿溶液的配制：称取40 mg溴甲酚绿，加100 mL pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，过滤。

1.2.2 标准曲线的制备 称取2 mg干燥至恒重的小檗碱对照品于100 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100 mL，摇匀。分别取1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2 mL标准溶液于 20 mL 量瓶中，用三氯甲烷稀释至10 mL，分别加入5.0 mL pH值为45的缓冲液、2.0 mL 0.04%溴甲酚绿溶液，剧烈振摇5 min后静置30 min。取5 mL下层液体，加入1.0 mL 0.01 mol/L 氢氧化钠乙醇溶液，摇匀后于628 nm处测吸光度。以小檗碱含量（C）为横坐标，吸光度（D）为纵坐标制作标准曲线，得回归方程。

1.2.3 空白溶液的制备 取10 mL三氯甲烷溶液于20 mL容量瓶中，分别加入5.0 mL缓冲液（pH值4.5）、2 mL 004%溴甲酚绿溶液，剧烈摇动5 min后静置30 min。取 5 mL 下层液，加入1.0 mL 0.01 mol/L氢氧化钠乙醇溶液摇匀，作为空白溶液。

1.2.4 乌药中总生物碱的提取 准确称取0.5 g乌药，用适量氨水湿润后密封放置30 min，索式提取2 h后将提取液置于TLC（薄层色谱），滴加碘化铋钾溶液至不显色为止；回收三氯甲烷，将残留物放冷至室温，再用三氯甲烷溶解并定容至20 mL。分别取 0.2 mL 提取物于量瓶中，加三氯甲烷定容至10 mL，混匀作为样品液。分别取10 mL样品液于3个20 mL容量瓶中，再分别加入5.0 mL缓冲液（pH值4.5）和2 mL 004%溴甲酚绿溶液，剧烈摇动5 min后静置30 min；取5 mL下层液，加 1.0 mL 0.01 mol/L氢氧化钠乙醇溶液，摇匀后于628 nm处测定吸光度，计算生物碱含量与回收率，回收率计算公式为：

3 结论

本研究采用酸性染料比色法测定乌药中的总生物碱含量，其原理是生物碱盐的阳离子与酸性染料的阴离子定量结合生成有色的络合物，可以定量地被某种有机溶剂萃取，因此通过测定萃取液的吸光度可以测定药材中总生物碱含量。在本试验中采用的生物碱的酸性染料为溴甲酚绿。同时考察了本方法的线性范围、稳定性、精密度、回收率，结果表明本方法符合紫外可见分光光度法的测试条件，可以作为乌药中总生物碱含量的测试方法。

生物碱大多具有复杂的环状结构，具有显著的生物活性，是乌药中重要的有效成分。本试验测得乌药中总生物碱含量为0.301 4%（n=3）。本试验建立的乌药中总生物碱含量的测试方法可以为乌药种源质量的筛选提供试验方法和参考依据。

参考文献：

[1]肖培根. 新编中药志[M]. 北京：化学工业出版社，2002：230.

[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[S]. 北京：化学工业出版社，2005：53.

[3]中国医学科学院药物研究所.中药志：第二册[M]. 北京：人民卫生出版社，1981：926.

[4]程显隆，魏 锋，冯玉飞，等. RP-HPLC法测定乌药中乌药醚内酯和乌药内酯的含量[J]. 药物分析杂志，2003，23（3）：225-227.

[5]许海丹，顾霞敏，叶文国. 乌药化学成分的分布特性研究[J]. 时珍国医国药，2010，21（1）：100-101.

[6]Han Z，Zheng Y，Chen N，et al. Simultaneous determination of four alkaloids in Lindera aggregata by ultra-high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2008，1212（1/2）：76-81.

[7]Gan L S，Yao W，Mo J X，et al. Alkaloids from Lindera aggregata[J]. Natural Product Communications，2009，4（1）：43-46.

[8]蒋爱芳，杨义芳，黄文武. 酸性染料比色法测定总生物碱的研究进展[J]. 中草药，2006，37（增刊）：359-362.

[9]蔡大可，李 耿，彭绍忠，等. 酸性染料比色法测定痹痛消膏中乌头生物碱的含量[J]. 中药新药与临床药理，2007，18（1）：57-59.

[10]敖茂宏，刘 海，吴明开. 酸性染料比色法测定不同产地流苏石斛中总生物碱的含量[J]. 江苏农业科学，2012，40（10）：282-283.endprint

摘要：用紫外分光光度法测定乌药中的总生物碱含量。先用索氏提取法提取乌药中的总生物碱，再以小檗碱为对照品，在pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，以溴甲酚绿指示液为显色剂，在628 nm波长下利用分光光度法测定乌药中的总生物碱含量。结果表明，小檗碱对照品在2.0～12.0 mg/L范围内呈线性关系，回归方程为D=0.008 2C+0167 1，r=0.999 1，乌药中的总生物碱含量为0.301 4%。本方法操作简便、迅速，测定结果准确、可靠。

关键词：乌药；总生物碱；分光光度法

中图分类号：R284.1；O657.32 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0266-02

乌药[Lindera aggregata （Sims）Kosterm]系樟科（Lauraceae）山胡椒属（Lindera）植物，为传统的理气止痛药[1]，具有温中散寒、理气止痛的功效，最早记载于唐代陈藏器《本草拾遗》。现代药理学研究表明，乌药具有广泛的药理活性[2-3]。乌药根的主要有效成分为异喹啉类生物碱及呋喃倍半萜[4]，其中生物碱和呋喃倍半萜及其内酯类成分是乌药的特征性成分[5-7]，具有较强的专属性，也具有一定的活性。为了确保乌药的质量标准评价有具体的量化指标，根据乌药中所含成分的特点，本研究采用酸性染料比色法测定乌药中的生物碱含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

主要仪器：紫外可见分光光度计（尤尼柯UV-4802）；98-1-C数显控温电热套（天津泰斯特）；索式提取器；电子天平；三氯甲烷（AR）；溴甲酚绿（AR）；小檗碱标准品（成都领航者生物技术有限公司）；pH值45的醋酸-醋酸钠缓冲液；0.01 mol/L氢氧化钠溶液（用乙醇溶解）。

试验所用中药材乌药样品采自江西赣南。

1.2 试验方法

本研究所用试验方法参照文献[8-10]的方法并加以改进。

1.2.1 缓冲液的配制 pH值4.5缓冲液的配制：将 0.2 mol/L 氢氧化钠滴加至冰醋酸中，调节pH值为45，即得醋酸-醋酸钠缓冲溶液。0.04%溴甲酚绿溶液的配制：称取40 mg溴甲酚绿，加100 mL pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，过滤。

1.2.2 标准曲线的制备 称取2 mg干燥至恒重的小檗碱对照品于100 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100 mL，摇匀。分别取1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2 mL标准溶液于 20 mL 量瓶中，用三氯甲烷稀释至10 mL，分别加入5.0 mL pH值为45的缓冲液、2.0 mL 0.04%溴甲酚绿溶液，剧烈振摇5 min后静置30 min。取5 mL下层液体，加入1.0 mL 0.01 mol/L 氢氧化钠乙醇溶液，摇匀后于628 nm处测吸光度。以小檗碱含量（C）为横坐标，吸光度（D）为纵坐标制作标准曲线，得回归方程。

1.2.3 空白溶液的制备 取10 mL三氯甲烷溶液于20 mL容量瓶中，分别加入5.0 mL缓冲液（pH值4.5）、2 mL 004%溴甲酚绿溶液，剧烈摇动5 min后静置30 min。取 5 mL 下层液，加入1.0 mL 0.01 mol/L氢氧化钠乙醇溶液摇匀，作为空白溶液。

1.2.4 乌药中总生物碱的提取 准确称取0.5 g乌药，用适量氨水湿润后密封放置30 min，索式提取2 h后将提取液置于TLC（薄层色谱），滴加碘化铋钾溶液至不显色为止；回收三氯甲烷，将残留物放冷至室温，再用三氯甲烷溶解并定容至20 mL。分别取 0.2 mL 提取物于量瓶中，加三氯甲烷定容至10 mL，混匀作为样品液。分别取10 mL样品液于3个20 mL容量瓶中，再分别加入5.0 mL缓冲液（pH值4.5）和2 mL 004%溴甲酚绿溶液，剧烈摇动5 min后静置30 min；取5 mL下层液，加 1.0 mL 0.01 mol/L氢氧化钠乙醇溶液，摇匀后于628 nm处测定吸光度，计算生物碱含量与回收率，回收率计算公式为：

3 结论

本研究采用酸性染料比色法测定乌药中的总生物碱含量，其原理是生物碱盐的阳离子与酸性染料的阴离子定量结合生成有色的络合物，可以定量地被某种有机溶剂萃取，因此通过测定萃取液的吸光度可以测定药材中总生物碱含量。在本试验中采用的生物碱的酸性染料为溴甲酚绿。同时考察了本方法的线性范围、稳定性、精密度、回收率，结果表明本方法符合紫外可见分光光度法的测试条件，可以作为乌药中总生物碱含量的测试方法。

生物碱大多具有复杂的环状结构，具有显著的生物活性，是乌药中重要的有效成分。本试验测得乌药中总生物碱含量为0.301 4%（n=3）。本试验建立的乌药中总生物碱含量的测试方法可以为乌药种源质量的筛选提供试验方法和参考依据。

参考文献：

[1]肖培根. 新编中药志[M]. 北京：化学工业出版社，2002：230.

[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[S]. 北京：化学工业出版社，2005：53.

[3]中国医学科学院药物研究所.中药志：第二册[M]. 北京：人民卫生出版社，1981：926.

[4]程显隆，魏 锋，冯玉飞，等. RP-HPLC法测定乌药中乌药醚内酯和乌药内酯的含量[J]. 药物分析杂志，2003，23（3）：225-227.

[5]许海丹，顾霞敏，叶文国. 乌药化学成分的分布特性研究[J]. 时珍国医国药，2010，21（1）：100-101.

[6]Han Z，Zheng Y，Chen N，et al. Simultaneous determination of four alkaloids in Lindera aggregata by ultra-high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2008，1212（1/2）：76-81.

[7]Gan L S，Yao W，Mo J X，et al. Alkaloids from Lindera aggregata[J]. Natural Product Communications，2009，4（1）：43-46.

[8]蒋爱芳，杨义芳，黄文武. 酸性染料比色法测定总生物碱的研究进展[J]. 中草药，2006，37（增刊）：359-362.

[9]蔡大可，李 耿，彭绍忠，等. 酸性染料比色法测定痹痛消膏中乌头生物碱的含量[J]. 中药新药与临床药理，2007，18（1）：57-59.

[10]敖茂宏，刘 海，吴明开. 酸性染料比色法测定不同产地流苏石斛中总生物碱的含量[J]. 江苏农业科学，2012，40（10）：282-283.endprint

摘要：用紫外分光光度法测定乌药中的总生物碱含量。先用索氏提取法提取乌药中的总生物碱，再以小檗碱为对照品，在pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，以溴甲酚绿指示液为显色剂，在628 nm波长下利用分光光度法测定乌药中的总生物碱含量。结果表明，小檗碱对照品在2.0～12.0 mg/L范围内呈线性关系，回归方程为D=0.008 2C+0167 1，r=0.999 1，乌药中的总生物碱含量为0.301 4%。本方法操作简便、迅速，测定结果准确、可靠。

关键词：乌药；总生物碱；分光光度法

中图分类号：R284.1；O657.32 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0266-02

乌药[Lindera aggregata （Sims）Kosterm]系樟科（Lauraceae）山胡椒属（Lindera）植物，为传统的理气止痛药[1]，具有温中散寒、理气止痛的功效，最早记载于唐代陈藏器《本草拾遗》。现代药理学研究表明，乌药具有广泛的药理活性[2-3]。乌药根的主要有效成分为异喹啉类生物碱及呋喃倍半萜[4]，其中生物碱和呋喃倍半萜及其内酯类成分是乌药的特征性成分[5-7]，具有较强的专属性，也具有一定的活性。为了确保乌药的质量标准评价有具体的量化指标，根据乌药中所含成分的特点，本研究采用酸性染料比色法测定乌药中的生物碱含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

主要仪器：紫外可见分光光度计（尤尼柯UV-4802）；98-1-C数显控温电热套（天津泰斯特）；索式提取器；电子天平；三氯甲烷（AR）；溴甲酚绿（AR）；小檗碱标准品（成都领航者生物技术有限公司）；pH值45的醋酸-醋酸钠缓冲液；0.01 mol/L氢氧化钠溶液（用乙醇溶解）。

试验所用中药材乌药样品采自江西赣南。

1.2 试验方法

本研究所用试验方法参照文献[8-10]的方法并加以改进。

1.2.1 缓冲液的配制 pH值4.5缓冲液的配制：将 0.2 mol/L 氢氧化钠滴加至冰醋酸中，调节pH值为45，即得醋酸-醋酸钠缓冲溶液。0.04%溴甲酚绿溶液的配制：称取40 mg溴甲酚绿，加100 mL pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，过滤。

1.2.2 标准曲线的制备 称取2 mg干燥至恒重的小檗碱对照品于100 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100 mL，摇匀。分别取1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2 mL标准溶液于 20 mL 量瓶中，用三氯甲烷稀释至10 mL，分别加入5.0 mL pH值为45的缓冲液、2.0 mL 0.04%溴甲酚绿溶液，剧烈振摇5 min后静置30 min。取5 mL下层液体，加入1.0 mL 0.01 mol/L 氢氧化钠乙醇溶液，摇匀后于628 nm处测吸光度。以小檗碱含量（C）为横坐标，吸光度（D）为纵坐标制作标准曲线，得回归方程。

1.2.3 空白溶液的制备 取10 mL三氯甲烷溶液于20 mL容量瓶中，分别加入5.0 mL缓冲液（pH值4.5）、2 mL 004%溴甲酚绿溶液，剧烈摇动5 min后静置30 min。取 5 mL 下层液，加入1.0 mL 0.01 mol/L氢氧化钠乙醇溶液摇匀，作为空白溶液。

1.2.4 乌药中总生物碱的提取 准确称取0.5 g乌药，用适量氨水湿润后密封放置30 min，索式提取2 h后将提取液置于TLC（薄层色谱），滴加碘化铋钾溶液至不显色为止；回收三氯甲烷，将残留物放冷至室温，再用三氯甲烷溶解并定容至20 mL。分别取 0.2 mL 提取物于量瓶中，加三氯甲烷定容至10 mL，混匀作为样品液。分别取10 mL样品液于3个20 mL容量瓶中，再分别加入5.0 mL缓冲液（pH值4.5）和2 mL 004%溴甲酚绿溶液，剧烈摇动5 min后静置30 min；取5 mL下层液，加 1.0 mL 0.01 mol/L氢氧化钠乙醇溶液，摇匀后于628 nm处测定吸光度，计算生物碱含量与回收率，回收率计算公式为：

3 结论

本研究采用酸性染料比色法测定乌药中的总生物碱含量，其原理是生物碱盐的阳离子与酸性染料的阴离子定量结合生成有色的络合物，可以定量地被某种有机溶剂萃取，因此通过测定萃取液的吸光度可以测定药材中总生物碱含量。在本试验中采用的生物碱的酸性染料为溴甲酚绿。同时考察了本方法的线性范围、稳定性、精密度、回收率，结果表明本方法符合紫外可见分光光度法的测试条件，可以作为乌药中总生物碱含量的测试方法。

生物碱大多具有复杂的环状结构，具有显著的生物活性，是乌药中重要的有效成分。本试验测得乌药中总生物碱含量为0.301 4%（n=3）。本试验建立的乌药中总生物碱含量的测试方法可以为乌药种源质量的筛选提供试验方法和参考依据。

参考文献：

[1]肖培根. 新编中药志[M]. 北京：化学工业出版社，2002：230.

[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[S]. 北京：化学工业出版社，2005：53.

[3]中国医学科学院药物研究所.中药志：第二册[M]. 北京：人民卫生出版社，1981：926.

[4]程显隆，魏 锋，冯玉飞，等. RP-HPLC法测定乌药中乌药醚内酯和乌药内酯的含量[J]. 药物分析杂志，2003，23（3）：225-227.

[5]许海丹，顾霞敏，叶文国. 乌药化学成分的分布特性研究[J]. 时珍国医国药，2010，21（1）：100-101.

[6]Han Z，Zheng Y，Chen N，et al. Simultaneous determination of four alkaloids in Lindera aggregata by ultra-high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2008，1212（1/2）：76-81.

[7]Gan L S，Yao W，Mo J X，et al. Alkaloids from Lindera aggregata[J]. Natural Product Communications，2009，4（1）：43-46.

[8]蒋爱芳，杨义芳，黄文武. 酸性染料比色法测定总生物碱的研究进展[J]. 中草药，2006，37（增刊）：359-362.

[9]蔡大可，李 耿，彭绍忠，等. 酸性染料比色法测定痹痛消膏中乌头生物碱的含量[J]. 中药新药与临床药理，2007，18（1）：57-59.

[10]敖茂宏，刘 海，吴明开. 酸性染料比色法测定不同产地流苏石斛中总生物碱的含量[J]. 江苏农业科学，2012，40（10）：282-283.endprint