龙胆苦苷生物合成途径研究进展

王彩云等

摘要：龙胆苦苷属裂环烯醚萜类化合物，是传统中药龙胆的主要有效成分，具有抗炎、保肝、利胆、健胃、抗肿瘤等药理活性，其生物合成途径可分为异戊烯基焦磷酸合成、裂环番木鳖酸生物合成和龙胆苦苷生物合成3个阶段，受脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶、脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶、细胞色素P450等多种酶的调控。本文综述了近年龙胆苦苷生物合成及其调控机制的研究现状，旨在为龙胆苦苷生物合成及其调控机制的进一步研究提供参考。

关键词：龙胆苦苷；生物合成；MVA；MEP；转录因子

中图分类号：R284.3 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0004-06

龙胆苦苷（gentiopicroside）广泛存在于龙胆科植物中，是滇龙胆（Gentiana rigescens）等药用植物中一类重要的次生代谢产物[1]，也是龙胆泻肝丸等180多种中药产品的主要药效成分。现代药理学研究证实，龙胆苦苷具有保肝、利胆、镇痛、抗炎、抗菌、健胃、抗肿瘤以及诱发神经轴突生长等作用[2-5]。目前，龙胆苦苷主要从滇龙胆、秦艽（Gentiana macrophylla）等野生植物中提取，但随着龙胆苦苷需求量的剧增，野生药用植物不能完全满足市场需求[6]。因此，对龙胆苦苷生物合成途径进行研究，利用基因工程、代谢工程等手段生产龙胆苦苷势在必行，明确龙胆苦苷的生物合成途径及其调控机制是利用生物技术手段生产龙胆苦苷的前提。

近年来，龙胆苦苷因其独特的药用价值以及在临床上的广泛应用[7]，受到国内外学者的广泛关注，并在龙胆苦苷的提取、含量测定、含量影响因素、药代动力学[8]、生物转化[9]和结构修饰等方面取得了大量科研成果。本文从目前已知的单萜生物合成途径出发，以近年的研究成果为依据，归纳出龙胆苦苷的基本合成途径，综述了龙胆苦苷的理化性质、生物合成途径以及该途径中关键酶的研究现状，以期为龙胆苦苷的开发和利用提供参考。

1 龙胆苦苷的理化性质

龙胆苦苷分子式为C16H20O9，分子量为356.3246，化学名为5-ethenyl-6-（β-D-glucopyranosyloxy）-5，6-dihydro-1H，3H-pyrano[3，4-O]pyran-1-one。龙胆苦苷纯品为白色粉末或淡黄（红）色针状结晶，有内酯苷类化合物的颜色反应，其表观油水分配系数理论值为-1.41，23 ℃下的表观油水分配系数为lgP=-1.21[10]，表明龙胆苦苷的亲水性较强，脂溶性较差，易溶解于水、甲醇及乙醇等溶剂。龙胆苦苷在龙胆科植物中普遍存在，于1854年首次从龙胆科植物黄龙胆（Gentiana lutea）中分离得到[11]；1961年，Canonica等初步获得龙胆苦苷的化学结构[12]；1968年，Inouye等最终确定了龙胆苦苷的化学结构（图1）[13]。

2 龙胆苦苷生物合成途径

龙胆苦苷属于单萜类化合物，其生物合成途径主要分为3个阶段：（1）通过甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）途径和2-甲基-赤藓醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途径合成异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）；（2） IPP经过不同的酶促反应合成裂环番木鳖酸；（3） 裂环番木鳖酸依次经过獐牙菜苷、獐牙菜苦苷，最终形成龙胆苦苷。

Coscia等于1967年用14C标记Swertia caroliniensis的甲羟戊酸，发现龙胆苦苷中出现14C，表明龙胆苦苷起始于甲羟戊酸途径[14]。据笔者所在课题组前期对滇龙胆三年生根、茎转录组测序研究发现，龙胆苦苷生物合成调控基因在MEP途径中上调，表明龙胆苦苷生物合成主要来源于MEP途径，部分来源于MVA途径。龙胆苦苷生物合成的第一阶段与一般的单萜类化合物在萜类基本骨架合成阶段完全相同，即首先在细胞质中通过MVA途径或者在质体中通过MEP途径合成萜类前体物质IPP，然后转化为GPP[15]。MVA途径自被人类发现至今已有半个世纪，其生物合成途径比较清楚，该途径首先由3分子的乙酰-CoA在乙酰乙酰辅酶A硫解酶和乙酰乙酰辅酶A合酶作用下缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA（HMG-CoA），缩合产物在其还原酶（HMGA）的催化作用下被还原成MVA，再经过脱羧和磷酸化反应生成GPP[16]。MEP途径是在脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）的缩合作用下，由1分子3-磷酸甘油醛和1分子丙酮酸生成1分子的1-脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP），并在其还原异构酶的催化作用下转化为2-甲基-赤藓醇-4-磷酸（MEP），MEP再依次经过2-甲基赤藓醇-4-磷酸胞苷转移酶、4-二磷酸胞苷-2-甲基赤藓糖激酶、2-甲基-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-焦磷酸合酶催化生成1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-焦磷酸（HMBPP），接着由异戊烯基焦磷酸激酶催化 HMBPP 生成IPP，IPP和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）之间的转换由IPP异构酶（IDI）来完成[17]。

龙胆苦苷生物合成第二阶段，即裂环番木鳖酸生物合成阶段，以GPP为前体，脱磷酸形成香叶醇。从香叶醇到裂环番木鳖酸的合成大约需要11个酶促步骤，目前只有5个被鉴定，即P450依赖性香叶醇10-羟化酶（G10H）、无环单萜伯醇脱氢酶（ADH）、单萜环化酶（MC）、S-腺苷-L-蛋氨酸：马钱苷酸甲基转移酶（LAMT）和P450依赖性裂环番木鳖酸合成酶（SLS）[18]。该阶段IPP和DMAPP在GPPS的催化作用下生成GPP，GPP合成后需要进行复杂的开环、环化和糖基化步骤，即GPP经香叶醇合成酶催化合成香叶醇，香叶醇C-2位置在细胞色素P450还原酶和香叶醇10-羟化酶的催化作用下生成10-脱氧香叶醇，这是裂环番木鳖酸生物合成的最重要的步骤。10-脱氧香叶醇被10-羟基香叶醇氧化还原酶（10HGO）氧化，在NAPDH氧化还原酶存在时，生成10-氧香叶醛，接着在单萜环化酶的催化下形成琉蚁二醛（iridodial），经缩醛反应形成iridotial，经过不断反应形成7-脱氧番木鳖酸（deoxyloganic acid），在7-脱氧番木鳖酸7-羟化酶作用下生成马钱苷酸，在S-腺苷-L-蛋氨酸：马钱苷酸甲基转移酶的催化作用下生成番木鳖酸，SLS催化番木鳖酸形成裂环番木鳖酸（secologanin）[18-19]。Coscia等发现牻牛儿基焦磷酸能并入到Swertia caroliniensis的有效成分番木鳖酸，进一步证明了GPP是龙胆苦苷生物合成的中间物[20]。1969年，Coscia等证明番木鳖酸是龙胆苦苷生物合成的前体[21]，这一结论同时也由Inouye和Grger这2个课题组分别在三花龙胆和长柄獐牙菜（Swertia petiolata）中得到证实。

在龙胆苦苷生物合成的最后一个阶段，裂环番木鳖酸经过不断的衍化生成獐牙菜苷（sweroside）、獐牙菜苦苷（swertiamarin），最终脱羟基形成龙胆苦苷[22]。Inouye等于1967年通过前体饲养试验证明在三花龙胆（Gentiana triflora）中甲羟戊酸内酯被并入到龙胆苦苷中；同时也出现在日本獐牙菜（Swertia japonica）的獐牙菜苷和獐牙菜苦苷中，獐牙菜苷中 14C 的含量约是獐牙菜苦苷含量的6倍，表明獐牙菜苷是獐牙菜苦苷的前体[14]。Tan等经过试验证明裂环番木鳖酸是龙胆苦苷等裂环烯醚萜类化合物的关键中间物[23]。随后，Inouye 等采用同位素示踪獐牙菜苷，并证明它是龙胆草（Gentiana scabra）中龙胆苦苷生物合成的一个中间物[24]。Jensen 等研究表明，在龙胆科植物中普遍存在着獐牙菜苷到獐牙菜苦苷再到龙胆苦苷的生物转化[22]。

目前，主要采用同位素示踪法，通过产物来反推其生物合成途径，并加以验证，是完善环烯醚萜类化合物次生代谢合成的一般策略。目前，龙胆苦苷的完整合成途径并不完全清楚，其基本的反应步骤如图2所示。

3 龙胆苦苷生物合成途径中的关键酶

随着龙胆苦苷需求量的剧增，其生物合成途径中的关键酶也备受关注。在龙胆苦苷的生物合成途径中，IPP合成阶段的大部分酶基因已被广泛克隆和研究；第二阶段（即裂环番木鳖酸生物合成阶段）只克隆到6个基因，其余5个基因还有待进一步研究；第三阶段从獐牙菜苷到獐牙菜苦苷再到龙胆苦苷的衍化机制并不清楚。

3.1 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA reductase，HMGR）催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）转化为MVA，这是一个不可逆过程，故HMGR被认为是MVA途径中的第一个限速步骤；HMGR在类异戊二烯的生物合成中起重要作用，也是细胞质萜类代谢中的重要调控位点[26]。植物中HMGR组成一个多基因家族，拟南芥（Arabidopsis thaliana）中HMGR酶由HMG1和HMG2基因编码[27]；马铃薯（Solanum tuberosum）中含有3个HMGR基因；番茄（Solanum lycopersicum）中含有4个HMGR基因；而在动物中仅发现1个HMGR基因。目前该基因已在杜仲橡胶（Eucommia ulmoides）[28]等植物和李斯特菌（Listeria monocytogenes）[29]等细菌中被克隆和研究。

3.2 脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶

脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS），催化MEP途径第一步反应，是MEP途径的第1个关键酶，它能与焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）共同作用，使丙酮酸脱羧后与3-磷酸甘油醛合成1-脱氧木酮糖-5-磷酸（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，DXP）[30]。DXS是MEP途径中植物萜类物质合成的第一个限速酶，该基因过量表达可促进下游相关萜类化合物的积累。Peebles等在长春花（Catharanthus roseus）萜类吲哚生物碱生物合成的研究中发现，DXS的超表达导致阿吗碱、洛柯定碱、水甘草碱等产物的大量增加，表明DXS在萜类生物合成中起重要作用[31]。Estévez等对拟南芥突变体clal-1进行研究发现，DXS对植物叶绿体及白色体的发育具有重要作用，主要表现在当突变体缺失DXS基因时呈现“白化”特征，添加脱氧木酮糖后有新的色素生成[32]。目前，已从玉米（Zea mays）[33]、番茄[34]、银杏（Ginkgo biloba）[35]等植物中获得DXS基因。近年来，大量研究表明DXS在类异戊二烯的MEP生物合成途径中起重要作用[36-37]。

3.3 脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶

脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）存在于质体中的MEP途径中，DXP通过DXR催化，以NADPH为还原剂，依赖二价阳离子，经原子重排和还原生成MEP，从而把DXP引入MEP途径[38]。DXR是MEP途径中的第2个限速酶，也是细胞质体中类异戊二烯化合物代谢的重要调控位点。Carretero等研究

发现，拟南芥中DXR基因的超表达能够增加MEP衍生质体类异戊二烯（如叶绿素和类胡萝卜素）的积累，表明DXR在MEP途径的调控中起重要作用[39]。Xing等对拟南芥dxr突变体进行研究发现，DXR基因的破坏会导致拟南芥突变体植株白化、矮小以及毛状体起始缺陷和气孔关闭，表明DXR基因在植物生长发育过程中起重要作用[40]。近年来，DXR在植物生长和发育过程以及MEP途径中的重要作用引起人们的广泛关注。目前，DXR基因已在细菌、藻类、植物、原生动物中发现，但在人体中并未发现。

3.4 2-甲基赤藓醇-4-磷酸胞苷转移酶

2-甲基赤藓醇-4-磷酸胞苷转移酶（2-C-methylerythritol-4-phosphate cytidyltransferase，MECT）属于胞嘧啶转移酶家族的一个成员，参与MEP途径的第三步酶促反应，将二磷酸胞苷（CDP）和MEP连接生成4-二磷酸胞苷-2-甲基-赤藓醇（CDP-ME），该反应依赖于胞苷三磷酸（CTP）[30]。目前，已从拟南芥、银杏等植物中发现该基因，但对其编码酶的相关功能研究并未见报道。为了验证MECT在萜类生物合成中的作用，Rohdich等用14C标记MECT，结果发现生成带有14C标记的CDP-ME；将大肠埃希菌（Escherichia coli）MECT基因转入辣椒，发现CDP-ME在质体中参与类胡萝卜素的生物合成，表明MECT与次生代谢产物合成有关[41]。

3.5 2-甲基-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶

2-甲基-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶（2-C-methylerythritol-2，4-cyclodiphosphate synthase，MECPS）是MEP途径上的第5个酶，催化CDP-MEP生成2-甲基-赤藓醇-2，4-环二磷酸（ME-cPP）。目前，Buetow等已在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）中证实MECPS具有潜在的药物功能测定作用，可作为治疗靶点[42]。Burlat等经Northern杂交和原位杂交发现MECPS与MEP途径中DXS、DXR基因以及下游途径中的香叶醇10-羟化酶（G10H）基因类似，显示出相同的细胞特异表达模式，表明MECPS在次生代谢产物的生物合成中起重要作用[43]。

3.6 异戊烯基转移酶

异戊烯基转移酶（prenyltransferase，PTs）催化IPP缩合成非环式的GPP，这是萜类合成中的重要过程。该基因已在紫草（Lithospermum erythrorhizon）[44]、苦参（Sophora flavescens）[45]、白羽扇豆（Lupinus albus）[46]等植物中被广泛研究。近年来，Nickerson等研究发现PTs与胆固醇的代谢有关[47]；Akhtar等经研究证实了番茄中顺式异戊烯基转移酶（cis-prenyltransferase，CPTs）与长链多聚类异戊二烯的合成有关，含有至少5个异戊二烯单位[48]。

3.7 牻牛儿基焦磷酸合成酶

牻牛儿基焦磷酸合成酶（geranyl pyrophosphate synthase，GPPS）是异戊二烯途径中一个很重要的酶，目前对GPPS的研究主要集中在其对单萜和倍半萜的影响[49]。GPPS催化IPP形成GPP，是植物单萜生物合成中的一个关键酶，在吸引传粉者和次生代谢产物的防御中起重要作用[50]。GPPS在多种植物中被分离，但有关其调控机制的研究很少。Martin等对葡萄（Vitis vinifera）中VvGPPS的转录进行分析，表明VvGPPS基因在单萜生物合成中起重要作用[51]。Chang等研究发现欧薄荷（Mentha piperita）中的MpGPPS包含2个具有催化功能的大亚基和2个非催化的具有调控功能的小亚基，并且证实与薄荷醇的生物合成有关[52]。

3.8 香叶醇合成酶

香叶醇合成酶（geraniol synthase，GES）是单萜芳香化合物香叶醇产生过程中的关键酶。Yoko等的18O同位素示踪试验研究结果表明GES催化牻牛儿基焦磷酸生成香叶醇，几乎专一性地在罗勒腺体中产生，在同型二聚体蛋白中存在活性，且需要Mn2+作为二价金属辅因子来激活[53]。Marc等研究结果表明酵母菌株erg20K197G中GES在YNB（酵母氮源基质）中的表达导致大量单萜化合物（香叶醇、沉香醇、香茅醇、橙花醇）的生物合成，且GES的表达导致香叶醇产量高出16倍；推断出GPP的不稳定导致GES特异性损失，不会导致香叶醇单萜合成酶功能的损失，但会使其失活[54]。目前，已在罗勒、紫苏、长春花中克隆到相关基因。罗勒GES可以用于评估单萜在不同植物中的异源表达谱。Marc等用根癌农杆菌转化葡萄，用浸花法转化拟南芥，农杆菌渗透瞬时表达烟草叶片均获得罗勒GES转基因植株，并在叶片中检测到高含量的香叶醇；另外，在大肠杆菌转化株培养基中检测到香叶醇[55]。

3.9 细胞色素P450还原酶

细胞色素P450还原酶（cytochrome P450 reductase，CPR）是真核生物的一个膜结合黄素蛋白，是细胞色素P450单加氧酶的催化反应所必须的，因为它在电子传递中的功能是从NADPH到细胞色素P450蛋白。许多P450蛋白与香叶醇到裂环番木鳖酸的生物合成有关，包括香叶醇10-羟化酶、7-脱氧番木鳖酸7-羟化酶和裂环番木鳖酸合成酶[56]。Shen等通过RT-qPCR研究发现，细胞色素P450单加氧酶（cyp71av1）在转基因黄花蒿植株转录水平上具有较高的表达量；HPLC分析显示在cyp71av1和细胞色素P450还原酶（cpr）的过表达植株中，青蒿素的含量明显增加，表明cyp71av1、cpr基因的过表达增加了黄花蒿（Artemisia annua）中青蒿素的含量[57]。细胞色素P450单加氧酶与内源性化合物的生物合成和外源性物质的分解代谢有关，他们的活性依赖于细胞色素P450还原酶。

3.10 细胞色素P450

细胞色素P450形成植物蛋白的最大家族，参与生物碱、萜类、类苯基丙烷等代谢产物的产生。P450蛋白基因在植物基因组中的数量占总注释基因的1%，表明植物中的大量反应依赖于各种P450[58]。在植物次生代谢过程中，P450催化羟基化反应和单加氧反应，另外还涉及到一些非常规反应，如甲二氧基-桥形成和石碳酸偶联反应等[59]。Chang等研究发现细胞色素P450参与龙胆苦苷的分解代谢[7]；在龙胆苦苷生物合成途径中，许多反应都是通过细胞色素P450蛋白进行催化的；单萜和倍半萜的基本碳氢骨架形成后，经P450加氧酶催化而发生羟化反应[60]。Sung等研究发现在龙胆苦苷生物合成中，香叶醇-10-羟化酶（Geraniol 10-hydroxylase，G10H）是一个极其重要的酶，它是CYP76B6家族中的一个细胞色素P450单加氧酶，在C-10位置羟化单萜香叶醇产生10-羟化香叶醇，是单萜和吲哚生物碱生物合成过程中裂环番木鳖酸产生的重要调控酶，也是不同植物中环烯醚萜类形成的第一个关键酶[61]。Wang等从川西獐牙菜（Swertia mussotii）中克隆到香叶醇10-羟化酶基因，并证实它具有香叶醇羟化的催化活性[62]。

3.11 7-脱氧番木鳖酸7-羟化酶

Katano等研究表明7-脱氧番木鳖酸7-羟化酶（7-deoxyloganin 7-hydroxylase，DL7H）能催化7-脱氧番木鳖酸转化为番木鳖酸，具有7-脱氧番木鳖酸的底物特异性，在金银花（Lonicera japonica）细胞悬浮培养物的微粒体中检测到其活性依赖于NADPH和分子氧，该酶学反应能被一氧化碳和许多细胞色素P450抑制剂（尤其是酮康唑）抑制，表明该反应能被细胞色素P450介导[63]。

3.12 裂环番木鳖酸合成酶

裂环番木鳖酸合成酶（secologanin synthase，SLS）在番木鳖酸形成裂环番木鳖酸的过程中催化环戊烷的氧化还原反应，属于细胞色素P450家族中CYP72A1亚家族成员，在长春花单萜生物合成中被鉴定[64-65]。Yamamoto等首次从金银花的细胞悬浮培养微粒体中检测到SLS[66]。SLS在反应中的作用依赖于NADPH和分子氧，能被一氧化碳和细胞色素P450抑制剂阻断，表明该反应受细胞色素P450调节。

4 展望

龙胆苦苷的生物合成途径是一个受多基因调控的、非常复杂的动态变化过程。随着分子生物学和代谢组学的发展，龙胆苦苷生物合成途径的基本框架和相关酶的研究已取得了一定的进展，但还有许多细节步骤不清楚，其生物合成途径仍有许多问题亟待解决。（1）香叶醇是裂环番木鳖酸生物合成的关键中间物，但香叶醇到裂环番木鳖酸之间的具体酶促反应至今还不清楚。在龙胆苦苷生物合成过程中，从裂环番木鳖酸到獐牙菜苷、獐牙菜苦苷以及龙胆苦苷之间的反应机制也不清楚，需要通过试验进一步研究。（2）龙胆苦苷的生物合成中，MVA和MEP途径中的酶大部分已被系统地研究，环烯醚萜类化合物生物合成过程中的调控酶只有细胞色素P450、G10H、SLS等被广泛研究，有关单萜环化酶、LAMT等的研究很少，而其他反应过程，如臭蚁二醛到7-脱氧番木鳖酸、獐牙菜苷与獐牙菜苦苷以及龙胆苦苷之间的酶未见报道。（3）代谢产物的生物合成途径都是由结构基因和调控基因共同调控的，龙胆苦苷生物合成途径中的部分结构基因和个别调控基因仅在部分植物中被克隆，如WRKY转录因子被报道间接参与龙胆苦苷的生物合成过程，但并未对其具体调控机制进行深入研究。目前，龙胆科植物的基因组还未被测序，在今后的研究中，需要通过对龙胆科具有代表性的药材（如龙胆或秦艽等）进行转录组测序，挖掘该途径中大量的结构基因和调控基因，并对其功能进行研究，进而从分子生物学水平阐明龙胆苦苷生物合成途径及其调控机制。因而，了解植物中龙胆苦苷的生物合成途径及其调控机理，并采用基因工程手段来生产龙胆苦苷，对野生龙胆资源的保护和解决市场上龙胆等药材的供需矛盾都具有重要的理论价值和实践价值。

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