微乳法制备丹皮酚纳米结构脂质载体

孙 雯 ，龙凯花 ，李彤晖 ，辛永洁 ，廉志远 ，李 晔

(1．陕西中医学院，陕西 咸阳 712046； 2．陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003）

纳米脂质载体，全称纳米结构脂质载体（NLC），是在固体脂质纳米粒（SLN）基础上发展起来的第2代新型给药系统。NLC保留了SLN生理相容性好，可生物降解，可控制药物释放，有良好的靶向性，易于大规模生产的优点[1]；同时，NLC在固体脂质载体中引入了液体脂质，使晶体混乱度增加，获得了较高的晶体缺陷，克服了SLN载药量低的问题;另外，许多难溶性药物在液态脂质中的溶解度要大于固态脂质，因此在NLC固态骨架中形成微小的液态脂质纳米格室也有利于载药量的提高。液态脂质的加入，还改善了SLN的药物突释和纳米粒混悬体水分含量高的缺点。与SLN相同，NLC的制备方法主要包括高压乳匀法、微乳法、乳化蒸发-低温固化法、微乳超声分散法、薄膜-超声分散法、溶剂扩散法等[2-5]。微乳是热力学稳定体系，采用微乳法制备NLC，可使其粒径大小可控、粒度分布均匀，由于制备速度快，无需在制备后分散，因此试验装置简单、制备条件温和、操作方便。丹皮酚(paeonol)具有良好的抗炎、抗过敏及抗感染作用，体外用药素有“天然抗生素”之称[6]。但丹皮酚具有易挥发、易氧化和生物半衰期短等特性，无法保持持久有效的血药浓度，影响制剂的稳定性和生物利用度[7-8]。本研究中利用NLC研究了具有缓释作用的丹皮酚制剂工艺。

1 仪器与试药

BP-61型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；GL-88B型涡旋混合仪（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；HJ-6型磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；SHA-C型恒温水浴振荡器（常州国华电器有限公司）；1026型高效液相色谱仪（安捷伦公司）；FOEA26810D型纯水机（MiLLipore公司）。丹皮酚提取物（含量不低于98%，西安天一生物技术有限公司）；丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号为 110752-200410）。

2 方法与结果

2．1 液态脂质、乳化剂和助乳化剂的筛选

采用高效液相色谱（HPLC）法[9-10]测定丹皮酚在不同介质中的溶解度，因此选择对丹皮酚溶解度较大的辅料进行处方筛选。

色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，流动相为甲醇 - 水（70 ∶30），检测波长为 274 nm，进样量为 10 μL，流速为 1 mL ／min，柱温为 30 ℃ 。

溶液制备与测定：精密称取丹皮酚对照品5．90 mg，加甲醇定容于10 mL容量瓶中，制成每1 mL含0．590 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。取过量丹皮酚细粉置10 mL具塞试管中，分别加入各种液态脂质、表面活性剂及助表面活性剂约1．0 g，密封，磁力搅拌混匀，于（42±1）℃水浴摇床中振荡至平衡后，以12 000 r／min的速率离心10 min，取上清液200 μL，置容量瓶中，精密称定，甲醇溶解并稀释至刻度，HPLC法检测药物含量，计算丹皮酚在各辅料中的饱和溶解度。平行测定3份，结果见表1。

筛选结果：液态脂质中油酸乙酯(EO)，油酸(AO)，辛酸葵酸三甘油酯(GTCC)对丹皮酚溶解度均较高，但黏度大的脂质不利于在水相中分散，乳化平衡所需时间较长，因此，用黏度较小的油相为佳[8]。因以可进一步考察微乳形成性能考察的液态脂质有油酸乙酯，GTCC，油酸聚乙醇甘油酯(LabrafiL M1944CS)，单亚油酸甘油酯(Maisine 35-1)，肉豆蔻异丙酯(IPM)；乳化剂有聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯(HS-15)，辛酸癸酸乙二醇甘油酯(LabrasoL)，聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH-40)；助乳化剂有甘油，二乙二醇单乙基醚(TranscutoL P)，聚乙二醇400(PEG400)，无水乙醇。

表1 丹皮酚在不同油、表面活性剂和助表面活性剂中的表观溶解度（42℃，n＝3）

2．2 伪三元相图的绘制

不同固态脂质对初乳液（微乳）形成的影响：以油酸乙酯为液态脂质，考察固态脂质硬脂酸、单硬酯酸甘油酯对初乳液形成的影响，并绘制伪三元相图，见图1。可见，两种固态脂质形成微乳液的面积与其加入量呈负相关；硬脂酸的 O／W型微乳面积明显大于单硬酯酸甘油酯。

图1 不同固态脂质对初乳液的影响

不同液态脂质对初乳液形成的影响：以硬脂酸为固态脂质，考察液态脂质 GTCC，LabrafiL M 1944CS，油酸乙酯，Mainsine 35-1，IPM对初乳液形成的影响，并绘制伪三元相图，见图2。可见，5种乳化剂均能形成微乳，其中GTCC，油酸乙酯，IPM的伪三元相图下微乳面积较大。

不同乳化剂对初乳液形成的影响：以硬脂酸为固态脂质，油酸乙酯为液态脂质，考察乳化剂泊洛沙姆，LabrasoL，RH-40，HS-15，卵磷脂对初乳液形成的影响，绘制伪三元相图，见图3。可见，卵磷脂和泊洛沙姆188不能形成微乳；伪三元相图下，HS-15形成的微乳面积最小。

图2 不同液态脂质对初乳液的影响

图3 不同乳化剂对初乳液的影响

不同助乳化剂对初乳液形成的影响：以硬脂酸为固态脂质，油酸乙酯为液态脂质，考察助乳化剂 PEG400、1，2-丙二醇、TranscutoL P、无水乙醇、甘油对初乳液形成的影响，绘制伪三元相图，见图4。可见，各助乳化剂均能不同程度地形成微乳液。但考虑到乙醇的皮肤刺激性，因此后续筛选将不列入无水乙醇。

图4 不同助乳化剂对初乳液的影响

2．3 过冷态处方的去除

对伪三元相图筛选出的9个微乳处方进行“过冷态”处方试验，凡不能在0℃冷水中分散，形成混悬液的，即认为是“过冷态”处方，对其舍弃。结果见表2。

表2 待选处方组成及其0℃分散表观性状表

2．4 载药微乳液的制备

按表 2 中 1，2，3，5，6 处方，在（42 ±1）℃ 水浴下加入 10% 丹皮酚药物，以微乳液仍澄清透明、离心后不分层为指标评定可载药微乳液。结果表明，加入丹皮酚后，处方 1，2，6流动性好，离心后不分层，可作为制备丹皮酚NLC备用处方。处方3，4离心后分层，舍去。

2．5 丹皮酚NLC的制备

取处方量硬脂酸和油酸乙酯（42±1）℃加热混匀，加入10%丹皮酚，磁力搅拌，加入处方量LabrasoL，TranscutoL P和水制备成澄明丹皮酚NLC微乳液，并将其加热至60℃以上，用预热至同样温度的注射器吸取1 mL微乳液，逐滴快速分散于10 mL的0℃冷水中，即形成丹皮酚NLC混悬液。

3 讨论

本试验在丹皮酚的NLC制备方法上采用了微乳法，此方法制备NLC的初乳液所需设备简单、操作方便易行。试验前期结果表明，硬脂酸、单硬脂酸甘油脂等固态脂质的最低熔点约在40℃，而丹皮酚晶体在45℃即可熔融成液态，因此对各介质溶解性能的考察温度应设定在40～45℃。采用绘制伪三元相图筛选微乳初乳液处方。分别对构成处方的固态脂质、液态脂质、乳化剂、助乳化剂进行微乳液的滴定，初选构成处方辅料。通过加药粉、过冷液等试验，筛选出备选处方。通过体外经皮渗透试验，优选透皮渗透率高、突释现象较弱的处方。文献报道，NLC的分散粒径和初乳液与分散液的温差呈负相关，即初乳液与分散液的温差越大，形成的NLC粒径越小；分散时乳滴越小，越容易均匀分散，分散粒径趋向于小。对此，NLC的分散工艺还有待进一步考察。所谓“过冷态”，即温度降至脂质熔点以下时类脂不发生结晶现象。本试验制备NLC初乳液产生过冷态的原因主要有混合脂质作为载体材料降低了结晶度，打破晶格的有序性；粒径太小及乳化剂的加入，导致类脂凝固被阻滞。NLC过冷态的形成会严重影响缓释效果，因此对形成过冷态处方的筛除非常重要。

微乳具有稳定的纳米级结构，但仍然存在油水界面，表面活性剂在油相、水相和界面间快速交换，达到一种动态平衡。微乳稀释冷却时，表面活性剂将向分散介质迅速扩散而流失。失去部分表面活性剂保护的微乳中未固化的脂质油相互融合使粒径增加。已形成的纳米粒也会随处方不同稳定性有差异。缩短固化时间有利于得到粒径小、稳定性好的产品。

微乳是一种热力学稳定体系，其制备速度快，且无需在制备后立即分散，使得NLC制备工艺操作更加灵活。由于注射器针尖滴出的微乳液滴可以很小，每滴与分散介质接触时都能保证较高的稀释倍数。因此微乳法制备NLC时总的稀释倍数可以很小，甚至小于1。其产品的脂质浓度可以比溶剂乳化法高，但仍比高压乳匀法小[4]。乳化剂用量大是微乳法制备NLC的一个缺点。表面活性剂可以考虑用透析或超速离心等方法除去。本试验制得的丹皮酚NLC同时具有缓释作用，可以制成亲水凝胶和软膏而用于局部给药[11]。

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