反相高效液相色谱法测定昆仑雪菊中木犀草素的含量

赵文惠，朱雅琪，李新霞

（新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011）

昆仑雪菊又名“血菊”，维吾尔语“古丽恰尔”，系菊科金鸡菊属两色金鸡菊 （Coreopsis tinctoria Nutt）一年生草本植物，分布于新疆和田地区海拔3000m左右的昆仑山系［1］。昆仑雪菊具有清热解毒、活血化瘀、健脾胃等功效，维吾尔族人民用花泡茶饮，用于治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒［2］。昆仑雪菊中含有黄酮、多糖、皂苷、氨基酸、挥发油等活性成分［3］。现代药理学研究表明该药材具有明显的抗氧化、降血压和降血脂等多种生物活性［4－5］。其中木犀草素是重要的黄酮类成分，最新文献报道木犀草素对全身恶性肿瘤的生长有抑制效应［6］；木犀草素能抑制炎症反应，并改善胰岛素在血管内皮细胞的敏感性［7］；木犀草素具有多靶点抗肿瘤作用，是一种非常有前途的潜在抗肿瘤药物［8］。

已有研究表明昆仑雪菊含有木犀草素［9］。但昆仑雪菊中木犀草素含量测定未见报道，本研究建立反相高效液相色谱法测定昆仑雪菊花中木犀草素含量的方法，为今后昆仑雪菊化学成分的研究、药材质量标准研究等提供实验方案，同时为合理开发利用昆仑雪菊提供一定的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2489紫外检测器，自动进样器、在线脱气装置，Empower 2色谱工作站。

1.2 试药 昆仑雪菊产自和田地区昆仑山区，由新疆医科大学药学院胡君萍博士鉴定为菊科金鸡菊属一年生草本植物两色金鸡菊 （Coreopsis tinctoria Nutt）的干燥花蕾，木犀草素对照品（批号12113041）购于上海同田生物技术股份有限公司，甲醇为色谱纯，实验用水均为 Milli－Q纯水仪制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相：乙腈－2%冰醋酸，梯度洗脱（表1），pH＝3.0，测定波长350nm，柱温35℃，流速1.0mL／min。

2.2 标准溶液的制备 精密称取木犀草素5mg于5mL容量瓶中，配置为1mg／mL的储备液。精密量取储备液100μL于10mL容量瓶稀释至刻度，得到10μg／mL的木犀草素标准溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取雪菊药材0.5g，加入70%（V／V）甲醇10mL，40℃下超声提取30min，提取液15000r／min离心10min，取上清液1mL于10mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，进样分析。

2.4 系统适用性实验 取供试品溶液10μL进样，记录色谱图，木犀草素峰的保留时间为18.336min，各峰与相邻峰的分离度均＞1.5，拖尾因子T＝1.04，理论板数按木犀草素峰计算大于2000。重复性试验RSD＜2%（图1）。

表1 梯度洗脱

图1 HPLC图谱

2.5 标准曲线 分别精密量取木犀草素标准溶液（10μg／mL）100、200、400、600、800μL及1mL于10 mL容量瓶中，稀释至刻度。得到浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg／mL的标准系列。取上述系列质量浓度溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤，进样，得系列浓度对应峰面积和保留时间。以对照品溶液的质量浓度（X）为横坐标，色谱峰面积 （Y）为纵坐标，绘制标准曲线，其线性方程：Y＝－36.71＋37440.4 X，相关系数：r＝0.9999，表明木犀草素在0.1～1.0μg／mL浓度范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 分别吸取对照品溶液0.4、0.6、1.0μg／mL，分别取10μL进样测定，低、中、高各浓度重复测定5次，峰面积RSD均＜2%，表明仪器精密度良好。

2.7 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品溶液（2.871μg／mL）共9份，每份1mL于10mL容量瓶中，分别加入木犀草素对照品（木犀草素浓度为2μg／mL）溶液0.1、1.0、2.0mL各3份，稀释至刻度，HPLC法测定，记录峰面积，计算回收率，结果平均回收率为94.90% ，RSD为0.69%，见表2。

2.8 重复性试验 以供试品溶液制备方法平行制备5份样品，进样测定，测得昆仑雪菊中木犀草素的含量为0.16mg／g，RSD为1.2%。

2.9 稳定性试验 吸取同一供试品溶液10μL，分别于0、2、4、6、8、12h进样，测定峰面积 RSD＝0.8%，表明12h内供试品溶液仍保持稳定。

表2 回收率实验结果

3 结论

3.1 提取条件的确定 对比回流提取与超声提取方法，木犀草素含量相似。但超声提取法更加方便快捷，故选用超声提取法对样品进行处理。分别对30%、50%、70%、100%甲醇和30%、50%、70%、100%乙醇、水等溶剂对样品进行超声提取，最后70%的甲醇提取液中木犀草素的含量最高，故选择用70%甲醇进行提取。

3.2 提取温度的确定 采用70%甲醇分别于30℃、40℃、50℃下超声提取30min。最终测定结果，40℃下提取木犀草素含量较高，故选择在40℃下提取。

3.3 提取时间的确定 分别将样品用70%甲醇在40℃下超声提取10、20、25、30、40min。测定后为提取30min木犀草素的含量最高，故雪菊样品提取时间确定为30min。

3.4 色谱条件的确定 分别采用了乙腈－0.1%磷酸、甲醇－0.1%磷酸、乙腈－2%冰醋酸、甲醇－2%冰醋酸等色谱系统，最终乙腈－2%冰醋酸色谱系统分离度高，保留时间较短，峰形较好，满足分析要求，故选用乙腈－2%冰醋酸对样品进行测定。采用梯度洗脱分离了近8个色谱峰，其中在10min处木犀草苷和马里苷对照品峰保留时间相同，通过峰纯度检测，在峰尾处同时含有马里苷和木犀草苷的光谱图，说明峰不纯，有待进一步分离；槲皮素在20min左右有个色谱峰，但含量较少，无法达到定量限。

［1］ 新疆植物志编辑委员会.新疆植物志：5［M］.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：93.

［2］ 刘伟新，邓继华，徐鸿.一种金鸡菊花的生药学研究［J］.中国民族医药杂志，2009，23（1）：24－25.

［3］ 梁淑红，哈木拉提，庞市宾，等.金鸡菊提取物降血压化学成分实验研究［J］.时珍国医国药，2010，21（7）：1619－1621.

［4］ 木合布力·阿布力孜，张燕，景兆均，等.新疆昆仑雪菊化学成分的初步定性研究［J］.新疆医科大学学报，2010，33（6）：628－630.

［5］ 张燕，李琳琳，木合布力·阿布力孜，等.新疆昆仑雪菊5种提取物对α－葡萄糖苷酶活性的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（7）：166－169.

［6］ Shailendra K.Luteolin and its inhibitory effect on tumor growth in systemic malignancies［J］.Exp Cell Res，2013，19（3）：777－778.

［7］ Zhu Deqiu，Liu Kang，Yi Jiali，et al.Luteolin inhibits in flammatory response and improves insulin sensitivity in the endothelium［J］.Biochimie，2011，9（3）：506－512.

［8］ 张芳芳，沈汉明，朱心强.木犀草素抗肿瘤作用的研究进展［J］.浙江大学学报：医学版，2006，35（5）：573－578.

［9］ 赵军，孙玉华，徐芳，等.昆仑雪菊黄酮类成分研究［J］.天然产物研究与开发，2013，24（1）：56－59.