小艾飞蜜膏质量标准研究

米仁沙·牙库甫， 热娜·卡斯木， 努尔阿尼也·热合曼， 胡君萍， 帕丽达·阿不力孜

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

小艾飞蜜膏(又称艾飞蜜膏)由高良姜、荜茇等5味维吾尔药材组成，是由维吾尔医学验证并长期在新疆维吾尔医医院使用的医院复方制剂[1-3]。目前临床应用时将复方中各味药材共研细粉，加以炼蜜制成膏剂服用。该剂型较为粗糙，用药剂量难以控制，从而往往影响药效。为进一步提高该药制剂的科学性，加强对该制剂质量的可控性，本实验对其进行了质量分析研究，建立了荜茇、高良姜的薄层鉴别方法和胡椒碱、高良姜素含量的高效液相测定方法，为该药的质量控制提供有效的方法。

1 仪器与材料

1.1仪器高效液相色谱仪SHIMADZU(日本岛津)，SPD-M20A 紫外可见分光检测器，色谱柱：Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，UV-260 紫外分光光度计(日本岛津)。

1.2材料高良姜、荜茇等药材购于新疆维吾尔医医院，高良姜对照药材(121263-200503)、高良姜素(111699-200501)、胡椒碱(0775-200203)(中国药品生物制品鉴定所)，高良姜阴性样品和荜茇阴性样品按复方小艾飞蜜膏工艺自制，硅胶G(青岛海洋化工厂)，甲醇、乙睛为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1荜茇的薄层色谱鉴别取小艾飞蜜膏2 g，加10 mL乙醇超声提取30 min，过滤，挥干，残渣加无水乙醇1 mL溶解作为供试品溶液。按处方比例称取除荜茇外各药材，按工艺提取，同法制成缺荜茇空白对照液。另取胡椒碱对照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液作为对照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G预制薄层板上，以苯∶醋酸乙酯∶丙酮(7∶2∶1) 为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色斑点[4-5]，见图1、2。

1～3：小艾飞蜜膏；4：阴性对照样品; 5：胡椒碱

2.2高良姜的薄层色谱鉴别取小艾飞蜜膏约1g，置于50mL锥形瓶，加适量甲醇超声、过滤，作为供试品溶液。取高良姜对照药材粉末约1g，加无水乙醇20mL，超声提取，共3次，过滤，滤液合并，滤液浓缩至5mL，作为对照药材溶液。另取高良姜素对照品，加无水乙醇制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。阴性对照品溶液的制备：按处方除去高良姜配制成高良姜阴性样品，称取0.5g，按上述供试品溶液制备得阴性对照溶液。取上述4种溶液各10μL，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸(10∶1∶1∶0.5)为展开剂，预饱和10min后展开，展距约12cm，取出，晾干，喷以3%三氯化铁水溶液显色。供试品色谱中在与对照药材、自制对照品色谱相应的位置上显相同的颜色斑点，阴性对照液色谱中，在与对照药材色谱相应的位置处均无斑点[4,6]，鉴别结果见图3、4。

1～3：小艾飞蜜膏； 4：高良姜对照药材；5：阴性对照样品；6：高良姜素

2.3胡椒碱的含量测定[7-8]

2.3.1 色谱条件 色谱柱为WatersC18(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为甲醇∶水(77∶23)，流速为0.8mL/min，柱温为25℃，检测波长为343nm。

2.3.2 系统适用性试验 取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪测试,胡椒碱的保留时间为10.25min。理论塔板数以胡椒碱计为4 500，胡椒碱与相邻未知色谱峰的分离度>1.5。

2.3.3 干扰试验 取对照品溶液、阴性样品溶液各10μL，按上述色谱条件进行测定，结果阴性样品对测定无干扰，所得色谱图见图5。

A：胡椒碱对照品 B：小艾飞蜜膏 C：缺荜茇阴性对照样品

2.3.4 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取胡椒碱对照品3.0mg置25mL棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再精密量取5mL至25mL棕色量瓶中, 加无水乙醇至刻度，摇匀，配制成每1mL含24μg的对照品溶液。供试品溶液的制备：取艾飞蜜膏0.1g，精密称定，置50mL棕色量瓶中，精密加无水乙醇50mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，放置片刻，取上清液用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。同法制备不含荜茇的阴性样品溶液。

2.3.5 线性关系考察 分别精密取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μL注入液相色谱仪，测定其峰面积，以峰面积对进样量(μg)进行线性回归，得回归方程为：Y=11 354X-20 690.6，r=0.999 9，结果表明：胡椒碱在24～144μg浓度范围内呈良好的线性关系。

2.3.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液10μL，重复进样5次，记录峰面积，RSD=0.43%。

2.3.7 稳定性试验 取同一样品溶液分别于0、1、2、4、6、8h按“2.3.1”项下色谱条件测定,记录色谱峰峰面积，结果在8h内峰面积无明显变化，RSD=1.50%。

2.3.8 重复性试验 取同一批号的样品5份，按照“2.3.1”项下色谱条件测定，结果样品中胡椒碱的平均含量为2.983 5mg/g，RSD=1.02%，表明本法重现性好。

2.3.9 加样回收率试验 取已知含量的样品0.05g6份，精密称定，分别精密加入胡椒碱对照品溶液(1.2mg/mL)各1.0mL，水浴蒸干，按照“2.3.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为100.09%，RSD=1.04%，见表1。

表1 胡椒碱的加样回收率试验(n=6)

2.3.10 样品含量测定 精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱记录峰面积，按外标法计算胡椒碱的含量，结果见表2。

2.4高良姜素的含量测定[9-10]

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Symmetry十八烷基键合硅胶(4.6mm×250mm，5μm),流动相为乙睛∶水∶磷酸(55∶45∶0.1),检测波长为267nm,流速为0.7mL/min,柱温为40℃。此条件下高良姜素与其他组份达到有效分离，与前后蜂分离度>2，理论塔板数>3 000，阴性对照无干扰，见图6。

表2 样品含量测定结果(n=3)

A：高良姜素对照品 B：小艾飞蜜膏 C：高良姜对照药材 D：缺高良姜阴性对照样品

2.4.2 溶液制备 精密称取高良姜素对照品5.5 mg置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀,精密吸取1 mL置50 mL量瓶中, 加甲醇稀释至刻度，摇匀,得高良姜素对照品溶液。精密称取本品约0.1 g，置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，放置至室温，用甲醇稀释并定容，摇匀，滤过，精密吸取滤液4 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液。按处方比例配制缺高良姜提取物阴性空白对照，同法制成阴性对照溶液。

2.4.3 线性范围的考察 精密吸取高良姜素对照品溶液(0.002 16 mg/mL)分别进样1、2、3、4、5、6 μL，按上述色谱条件测定,得高良姜素峰面积积分值分别为10 765、22 960、35 591、47 891、59 981、72 176。以对照品进样量 X(μg) 为横坐标，峰面积积分值Y 为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为Y=5 693.4X-1 481.4，r= 0.999 9，表明高良姜素在2.16～12.96 μg 浓度范围内呈良好线性关系。

2.4.4 精密度试验 分别精密吸取浓度为4.36 μg/mL的高良姜素对照液10 μL，分别连续进样6次。测得RSD为0.97%，结果表明精密度良好。

2.4.5 稳定性试验 精密称取适量的本品内容物，按“2.4.2”项下制备样品溶液，6 h内(0、1、2、3、4、5、6 h)测定高良姜素百分含量7次。结果表明供试品溶液稳定，RSD为1.2%。

2.4.6 重复性试验 取同一批号样品，精密称取6份，按“2.4.2”项下制备样品溶液，测得高良姜素的含量平均值为5.762 mg/g ，RSD为2.8%。

2.4.7 加样回收率试验 取与重复性试验同一批样品6份，每份0.05 g，精密称定，按“2.4.2”项下制备样品溶液，分别加入对照品0.405、0.540、0.675 mg(浓度为3.24 mg/mL，取样体积分别为1.5、2.0、2.5 mL)。进样10 μL，按上述色谱条件测定，结果平均回收率为100.06%，RSD=1.17%，见表3。

表3 高良姜素加样回收率试验(n=6)

2.4.8 样品含量测定 取3批样品(20110516、20120123、20120426)，按“2.4.2”项下制备样品溶液，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按 “2.4.1”项下色谱条件进行测定，结果见表4。

表4 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

目前中成药质量标准的研究一般以TLC和 HPLC方法为主，采用合适的指标建立其标准。因此，本实验以特征成分胡椒碱和高良姜素为指标，采用 TLC法 和 HPLC法建立小艾飞蜜膏的质量标准。

由于复方所含药材中类似化学成分比较多，采用TLC法分析胡椒碱和高良姜素过程中,在《中国药典》规定的展开条件及显色剂的基础上做了细微调整。测定高良姜素的含量曾尝试采用甲醇∶0.5%磷酸的梯度洗脱(70∶30～50∶50)作为流动相[4-5]，发现效果均不理想，经摸索筛选采用本实验所采用的色谱条件为较好，高良姜素与其他组分色谱峰得到较好分离。在对胡椒碱[6-7]测定色谱条件的流动相进行选择时，曾对甲醇-水(70∶30)、甲醇-水(75∶25)、甲醇-水(65∶35)进行了比较研究，结果表明选用甲醇-水(77∶23)作为流动相胡椒碱与其他组分均能达到基线分离。

供试品溶液制备时对比了超声处理和回流提取，两者差异不显著，因超声处理较为方便，故选择超声处理提取。超声时间的考察：分别考察了超声10、20、30 及60 min后提取液中高良姜素和胡椒碱的含量，结果超声处理30 min后，高良姜素和胡椒碱基本提取完全，含量不再增加，故最后确定超声处理30 min。

本研究采用高效液相色谱法测定高良姜素和胡椒碱的含量，方法简单快速，样品用量少，结果准确可靠，为该制剂的质量控制提供了科学依据。

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