维吾尔族与汉族人群肠道菌群与高尿酸血症关系的研究

玛依娜·卡哈尔, 孙玉萍, 孜来古丽·米吉提, 张 蓓

(新疆医科大学基础医学院微生物学教研室， 乌鲁木齐 830011)

近年来代谢组学的发展促进了肠道微生物与健康和疾病研究的快速发展，微生物学研究中发现与人类共生共栖的肠道菌群与脂代谢紊乱、肥胖和胰岛素抵抗、代谢综合征等代谢性疾病的发生存在一定的联系。尿酸是人体内嘌呤代谢的终产物，嘌呤代谢又与肠道菌群密切相关。本课题组前期研究表明新疆汉族和维吾尔族的高尿酸血症发病率不同，表现出民族的差异[1]。本研究对新疆维吾尔族和汉族高尿酸血症患者和正常人群肠道菌群进行研究，旨在探讨肠道菌群与高尿酸血症的相关性及在高尿酸血症发病机制中的作用，为减少高尿酸血症及其他代谢性疾病的发生提供参考依据。

1 材料与方法

1.1研究对象选择汉族和维吾尔族高尿酸血症患者和正常人共265例，近3个月内未服用抗生素，排除胃肠道疾病和代谢性疾病可能影响肠道菌群变化的因素。研究对象的年龄均控制在20～70岁，三代直系血亲均为汉族和维吾尔族的男性及女性，在采样地区稳定居住期超过20 a，相互之间无血缘关系，对本课题研究知情同意者。结合1997年美国风湿病学会确定的原发性痛风诊断标准，并根据我国血尿酸调查结果确定诊断标准为：男性>417 μmol/L(7.0 mg/mL)，女性>357 μmol/L(6.0 mg/mL)。

1.2实验仪器与设备紫外分光光度计、PCR热循环仪、凝胶成像系统和DCodeTM System突变检测系统均为美国BIO RAD有限公司生产，粪便DNA提取试剂盒购自Qiagen生物科技有限公司；琼脂糖、RNaseA、EB染料(溴化乙锭)、2×Taq PCR Master Mix、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自新疆宝信生物试剂经销处,尿素、去离子甲酰胺购自新疆鹏程生物试剂经销处。16SrDNA V6～V8通用引物F968f-GC/R-1401的序列由上海生工生物公司合成。

1.3肠道菌群标本的采集及DNA提取粪便标本的采集及总DNA提取：采集清晨空腹粪便，放置无菌厌氧塑料采便袋后，排除空气，1×TE缓冲液稀释，放置冰盒中保存，2 h内送回实验室，-70℃保存备用。按照试剂盒说明提取粪便样品中的总DNA，提取后的DNA存放在-20℃冰箱备用。

1.4细菌总DNA的16SrDNA-PCR扩增采用细菌16S通用引物F968f-GC/R-1401的序列，与普通PCR不同之处是Primer上要加1个GC夹(GC Clamp)，GC夹的序列为： CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCG-GGGCGGGGGC，F968f-GC: 5′-CGCCCGCCGCGCG-CGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTAC-GGGAGGCAGCAG-3′,R-1401:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，用于扩增16SrDNA V6～V8可变区基因片段。 PCR反应总体系50 μL，其中10×Buffer 5 μL，4×dNTP混合物5 μL，MgCl23 μL，引物各2.6 μL，模板2 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，去离子水29.4 μL。PCR反应条件：预变性94 ℃ 4 min，变性94 ℃ 1 min，退火65 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 2 min，30个循环后 72℃下延伸10 min。

1.5PCR产物DGGE琼脂糖凝胶电泳配制40%和60%变性剂凝胶溶液各约13 mL。配置四层胶进行电泳，电泳条件，紫外凝胶成像仪中拍照，将所得到的16SrDNA-PCR产物通过DGGE分析。

1.6DGGE产物切胶回收测序、所测DNA序列经Clustal软件对准及鉴定挑取亮度较高的条带送往上海生工公司测序。测序仪器为ABI-PRISM3730，测序试剂为BigDyeterminator v3.1，用DNADIS计算各序列间分化距离，根据同源程度初步确定本菌的分类学地位。

2 结果

2.1细菌总DNA的16SrDNA-PCR扩增产物图细菌总DNA的16SrDNA-PCR扩增产物条带大小在450 bp左右，见图1。

M:DNA marker； 1～26：1～26号标本PCR产物

2.2PCR产物DGGE琼脂糖凝胶电泳图谱PCR产物DGGE琼脂糖凝胶电泳图谱见图2，图中每一个条带代代表1个菌科。

图2 1～22号标本肠道菌群DGGE图谱

2.3肠道优势菌株鉴定汉族和维吾尔族人群肠道菌群有12个细菌属：不可培养细菌(Uncultured bacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、直肠真杆菌属(Eubacterium rectale)、嗜果胶拟杆菌属(Bacteroides pectinophilus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、挑剔真杆菌属(Eubacterium eligens)、疣微菌属(Akkermansia)、粪球菌属(Coprococcus eutactus)、肠道产丁酸细菌属(Butyrate-producing bacterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcaceae bacterium)及Blautia luti strain bln属。

2.4高尿酸组和正常组肠道优势菌株分布比较正常组中多数为不可培养细菌、疣微菌属、直肠真杆菌属、肠道产丁酸细菌属、梭菌属、消化链球菌属和Blautia luti strain bln属。高尿酸组中主要有不可培养细菌、毛螺旋菌属、乳酸杆菌属，两组肠道优势菌株差异有统计学意义(χ2=143.415，P=0.000)，见表1。

表1 高尿酸组和正常组所检测条带数在12个菌属中的分布比较/例(%)

2.5汉族和维吾尔族人群肠道优势菌株分布比较新疆汉族人群肠道中除了乳酸杆菌属外，其他细菌属均高于维吾尔族，尤其嗜果胶拟杆菌属和消化链球菌属仅在汉族人群肠道检出，而粪球菌属、毛螺旋菌属和Blautia luti strain bln菌属检出率也远远高于维吾尔族；维吾尔族人群肠道中乳酸杆菌属远远高于汉族。2个民族人群肠道菌群的分布差异有统计学意义(χ2=102.534，P=0.000)，见表2。

表2 汉族和维吾尔族人群肠道细菌分布的比较/例(%)

3 讨论

高尿酸血症为细胞外液的尿酸盐呈超饱和状态，是以体内嘌呤代谢紊乱、尿酸增高为特征的疾病，可引起痛风和尿酸性肾病。在人类的消化道内，稳定殖居着相当庞大的微生物群系，对维持微生态平衡起着至关重要的作用。本研究发现新疆2个民族人群主要肠道菌群有12个细菌属：不可培养细菌(Uncultured bacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、直肠真杆菌属(Eubacterium rectale)、嗜果胶拟杆菌属(Bacteroides pectinophilus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、挑剔真杆菌属(Eubacterium eligens)、疣微菌属(Akkermansia)、粪球菌属(Coprococcus eutactus)、肠道产丁酸细菌属(Butyrate-producing bacterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcaceae bacterium)及Blautia luti strain bln属。

近年来的研究表明肠道微生物还作为一种环境因子可调整脂肪的储存和蓄积，同时病理性的肥胖也能够改变肠道微生态，肠道细菌的代谢性内毒素还可以激发肥胖和胰岛素抵抗[2-4]，因此肠道微生物被称作是人类的“代谢器官”，从事着许多没有被人类所知晓的代谢活动[5]。尿酸是人体内嘌呤代谢的终产物，而嘌呤代谢与肠道细菌密切相关。同位素跟踪研究显示，体内尿酸池中尿酸平均为1 200 mg，每天产生约750 mg，排出500～1 000 mg，约2/3经尿排泄，另1/3在肠道内被细菌分解排出，可见肠道菌群对于尿酸的分解、排泄起到一定的作用[6]。本研究发现高尿酸组中毛螺旋菌科Roseburia属、乳酸菌多于正常组，两组肠道优势菌属差异有统计学意义。

年龄、人种、膳食结构、生活习惯、抗生素治疗等因素会影响人肠道微生态系统及其群落结构，Mueller等[7]对法国、德国、意大利、瑞士4国230名健康个体的肠道微生物组成进行研究，发现同一人群微生物组成在不同年龄段不同，不同国家人群肠道中的肠道菌群构成也不同。国内Li等[8]利用细菌DNA指纹图谱和基因组标记测序等基因组技术，对一个四世同堂的中国家庭7位成员的肠道微生物组成和人体代谢特征进行了详细分析，发现个体仍具有其特有的肠道菌群结构特征，而且肠道菌群结构紊乱与糖尿病、肥胖症等许多疾病有关。但是肠道菌群主要受到基因的控制，人类尤其是同一民族和同一生活环境中的人群的肠道菌群的种类和数量是相对稳定的[9]。如进食大量肉的人比吃素食者的肠道中含有更多的拟杆菌；多食蛋白类食物者的肠道中以大肠杆菌为主的腐败菌生长旺盛；多吃糖类及酸牛奶者的肠道中则乳酸杆菌增多。本研究发现新疆汉族人群肠道中除了乳酸菌外，其他细菌属均高于维吾尔族人群，尤其嗜果胶拟杆菌和消化链球菌属仅在汉族人群肠道检出，而粪球菌、粪毛螺旋菌科Roseburia属和Blautia luti strain bln菌也远远高于维吾尔族，而维吾尔族人群肠道中乳酸杆菌远远高于汉族，可能与维吾尔族人群进食糖类和酸奶有关。而汉族人群嗜果胶拟杆菌和消化链球菌属检出，而嗜果胶拟杆菌和毛螺菌属均发酵果胶并产甲醇,因此维吾尔族人群未检出可能与汉族人群水果摄入高于维吾尔族有关。

由于肠道菌群与饮食的关系比较密切，因此其种类和数量会受到饮食结构的影响，而肠道中不可培养的细菌数量众多，人类对其知之甚少，本研究挑取的530个条带中经测序不可培养的细菌占到62.5%，因此对本实验研究的结果影响较大，高尿酸组和正常组以及2个民族人群肠道细菌分布的差异性并不是很大，但是仍然表现出一定的差异，希望在今后更为先进的检测技术的指导下对于人类肠道菌群与疾病的研究更加准确和具有科学性。

参考文献:

[1] 姚华,孙玉萍,王秋云,等.维吾尔族与汉族尿酸水平与糖、脂代谢紊乱关系的研究[J]. 新疆医科大学学报,2007，30(6):539-542.

[2] Fredrik B, Hao D, Ting W, et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage[J]. PNAS,2004 ,101(44):15718-15723.

[3] Ley RE, Backhed F, Turnbaugh P, et al. Obesity alters gut microbial ecology[J]. Proc Natl Acad Sci,2005,102(31):11070-11075.

[4] Cani PD, Amar J, Iglesias MA,et al. Metabolic Endotoxemia Initiates Obesity and Insulin Resistance[J]. Diabetes,2007,56(7):1761-1772.

[5] Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, et al. Microbial ecology: Human gut microbes associated with obesity[J]. Nature , 2006, 444(7122):1022-1023.

[6] Matthias A, Johnson RJ, Miyazaki H, et al. Molecular physiology of urate transport[J]. Physiology,2005,20:125-133.

[7] Mueller S, Saunier K, Hanisch C, et al. Differences in fecal microbiota in different European study populations in relation to age, gender, and country: a cross-sectional study[J]. Appl Environ Microbiol,2006,72:1027-1033.

[8] Li M, Wang B, Zhang M, et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes[J]. PNAS,2008,105(6):2117-2122.

[9] O′Hara AM, Shanahan F. The gut flora as a forgotten organ[J].EMBO Reports,2006,7(7):688-693.