HPLC法测定四季三黄片中黄芩苷的含量

吴继周， 王 燕, 韩海霞

(1新疆博尔塔拉蒙古自治州药品检验所， 新疆 博乐 833400； 2新疆维吾尔自治区人民医院药学部， 乌鲁木齐 830001；3新疆农业大学食品科学与药学学院， 乌鲁木齐 830052)

四季三黄片是由大黄、黄芩、黄柏、栀子经加工制成的复方制剂,具有消炎退热、通便利水的功效，用于口鼻生疮、咽痛齿痛、口干舌燥、目眩头晕、大便秘结、小便赤黄等，本品收载于《国家食品药品监督管理局标准》标准编号为YBZ05432006[1]。方中黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、凉血活血、安胎的功效。近年来发现黄芩根提取物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、解热镇痛、抗氧化以及清除氧自由基、治疗心血管疾病等作用[2]；黄芩苷为黄芩中的活性物质，现行药品标准中仅对方中大黄的有效成分大黄酸和大黄酚进行定量分析，没有黄芩苷的含量控制指标，难以保证药品的内在质量。本研究参照《中国药典》(2010年版)测定黄芩药材中黄芩苷含量的方法和文献[3-10]，应用高效液相色谱法测定四季三黄片中黄芩苷的含量。

1 仪器与试药

1.1仪器日本岛津高效液相色谱仪(LC-20AT一元泵，SPD-20A紫外检测器)，AS20500A超声波清洗器，METTLER AE240型电子分析天平。

1.2试药四季三黄片 (江西华太药业有限公司，产品批号070202、070545、070705)，黄芩苷对照品(中国药品生物制品检验所，批号110715-200514)，栀子(新疆博州药品检验所)，大黄(新疆博州药材公司)，黄柏(新疆博州药材公司)。乙腈：色谱纯(美国Fair Lawn.New Jersey)，水为纯化水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：0.2%磷酸溶液-乙腈(78∶22)；检测波长为276 nm，柱温22℃，流速为1.0 mL/min。

2.2溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成1 L含0.030 3 mg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 本品研匀后，取0.25 g精密称定，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇适量，经超声处理20 min后加70%乙醇至刻度定容，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 大黄粉碎成细粉；取栀子5 g，加水煎煮，煎液浓缩成稠膏；黄柏用60%乙醇渗漉，收集渗漉液，浓缩成稠膏；将栀子稠膏、黄柏稠膏与大黄粉末混匀至粘稠状，精密称定0.243 3 g，放入100 mL量瓶中，加70%乙醇适量，经超声处理20 min后加70%乙醇至刻度定容，即得。

2.3线性关系的考察精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20、30 μL，按上述色谱条件进行测定，以进样量为横坐标(X)，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程为Y=4×106X-5 279.7，r=0.999 9，结果表明黄芩苷进样量与峰面积在0.030 3～0.909 0 μg 范围内线性关系良好。

2.4阴性对照试验精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL进样测定，结果阴性对照溶液在与黄芩苷对照品相对应的保留时间位置上未见有吸收峰，说明本品中除黄芩苷以外的药物大黄、黄柏、栀子对含量测定无干扰,见图1～3。

图1 阴性对照溶液HPLC色谱图

图2 供试品溶液HPLC色谱图(22号峰为黄芩苷)

图3 对照品溶液HPLC色谱图(C 5号峰为黄芩苷)

2.5稳定性试验取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样5μL测定黄芩苷峰面积，结果RSD=0.44%(n=6)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.6精密度试验精密吸取黄芩苷对照品溶液5μL，连续进样5次，测定黄芩苷的峰面积，结果峰面积分别为527 146、531 648、527 163、526 076、529 921，相对标准偏差RSD=0.44%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.7重复性试验取供试品溶液6份，进样量为5μL，同法测定,其RSD为0.52%，表明重现性良好。

2.8回收率试验取本品适量，研细，精密称取9份，每份约0.104g，分3组分别加入适量对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制备并测定，结果平均回收率为99.08%，RSD=0.99%,见表1。

表1 黄芩苷加样回收率试验结果(n=9)

2.9样品测定取3个批号的供试品溶液各3份，分别进样3次，测定色谱峰面积，结果3批三黄四季片中黄芩苷的平均含量分别为15.8、23.5、14.9 mg/g。

3 结论

黄芩苷为淡黄色细针晶，相关提取方法有水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等。通过反复变换提取溶剂的实验，得出用70%乙醇提取黄芩苷的效果比较好，故用70%乙醇做提取溶剂。

关于黄芩苷的色谱条件，文献报道较多，运用较多的是2%磷酸∶乙腈(72∶8)，但对于四季三黄片中黄芩苷的分离不太好，有杂峰，所以没有选用此比例。研究曾选用磷酸-水-乙腈多种不同梯度浓度做流动相，得到2%磷酸-乙腈(78∶22)组成的流动相在波长为276 nm波长处得到的峰分离度好,分离时间适宜，而且该系统溶剂也适合黄芩苷药材及其各种炮制品的质量分析。

参考文献：

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