高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速筛查饮料中6种人工合成甜味剂*

杨君，王建华，刘靖靖，李立，颜冬云

（1.青岛大学，山东青岛 266071； 2.山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002；3.中国检验检疫科学研究院，北京 100123）

高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速筛查饮料中6种人工合成甜味剂*

杨君1，2，王建华2，刘靖靖2，李立3，颜冬云1

（1.青岛大学，山东青岛 266071； 2.山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002；3.中国检验检疫科学研究院，北京 100123）

建立了高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱快速检测饮料中糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖6种人工合成甜味剂的方法。样品经水提取，采用C18色谱柱，以甲醇和0.1%甲酸-10 mmol／L甲酸铵溶液为流动相，梯度洗脱，四极杆飞行时间串联质谱电喷雾负离子模式检测。各化合物在0.02～2.0 mg／L范围内均呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.998。样品平均添加回收率为63.0%～113.2%，测定结果的相对标准偏差均小于9.6%(n=5)。该方法简便快捷，选择性好，灵敏度高，可满足国内外现行法规的限量要求。

液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱；人工合成甜味剂；筛查；饮料

甜味剂是一类重要的食品添加剂，按其来源可以分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。人工合成甜味剂在人体内不进行代谢吸收，用量小，不提供热量或产生的热量少而甜度高，因而被广泛应用于食品饮料中［1］。多数国家批准使用的品种主要有安赛蜜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精、三氯蔗糖等［2］。科学研究表明，人工合成甜味剂能致使某些动物产生肿瘤，因此为避免其对人体产生潜在危险，必须限制食品饮料中甜味剂的用量。

美国、欧盟、日本等国对食品中甜味剂的使用有严格规定［3］，我国卫生部发布的GB 2760-2011《食品添加剂使用标准》中规定，饮料中安赛蜜的限量为0.3 g／kg，糖精钠为0.15 g／kg，甜蜜素为0.65 g／kg，三氯蔗糖为0.25 g／kg，阿斯巴甜和纽甜可在任何食品中按需使用。食品中甜味剂的检测方法［4］主要有高效液相色谱法［5-6］、液相色谱-质谱法［7-8］、液相色谱-串联质谱法［9-11］、气相色谱法［12-13］等。

四极杆飞行时间质谱(Q TOF MS)属于高分辨质谱，可根据化合物及碎片离子的精确质量对其进行定性分析，增加了定性的准确度。使用液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱检测饮料中甜味剂的国外报道较少［14］，国内则未见报道。笔者用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q TOF MS)分析技术，建立了饮料中糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖6种常用人工合成甜味剂的检测方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪（Agilent 1200型）／四极杆飞行时间串联质谱仪（6520 Accurate Mass型）：美国Agilent公司；

电子天平：PL303型，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；

数控超声波清洗器：KQ-500DB型，昆山市超声仪器有限公司；

乙腈、甲酸、乙酸铵、甲酸铵：色谱纯，美国Honeywell Burdick &Jackson Muskegon公司；

安 赛 蜜(Acesulfame-K)、糖 精 钠(Sodium Saccharin)、甜 蜜 素 (Cyclamate)、三 氯 蔗 糖(Sucralose)、阿斯巴甜(Aspartame)、纽甜(Neotame)标准物质：纯度均为99.0%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

实验室用水由Milli-Q纯水系统制备。

1.2 标准溶液的配制

称取上述标准品各0.050 0 g于50 mL棕色容量瓶中，用纯水溶解并定容，配制成1 mg／mL的混合标准储备液，置于冰箱中4℃保存备用。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Eclispe XDB-C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm，美国Agilent公司)，卡套式保护柱(C18填料)；柱温：30℃；进样体积：5 μL；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸-10 mmol／L甲酸铵溶液；梯度洗脱程序：0～1.0 min为98% B，1.0～5.0 min由98% B降至20% B，5.0～7.0 min为20% B，7.0～20.0 min为98% B；流速：0.3 mL／min。

1.3.2 Q TOF MS条件

电喷雾源(ESI)负离子模式；干燥气：氮气，温度为350℃，流量为11 L／min；雾化气压力：275.8 kPa(40 psi)；毛细管电压：4 000 V；传输电压：140 V；扫描模式：全扫描；扫描范围：m／z 100～1 100；参比离子：m／z 121.985 6，1 033.988 1。

1.4 实验方法

取1.0 mL样品至50 mL容量瓶中，用纯水定容至标线，超声提取20 min，过0.22 µm尼龙滤膜，滤液供HPLC-Q TOF MS测定。

2 结果与讨论

2.1 分析条件的优化

2.1.1 色谱流动相的优化

对色谱流动相进行了优化，考察了甲醇-乙酸铵-甲酸和甲醇-甲酸铵-甲酸体系，发现甲醇-乙酸铵-甲酸体系下阿斯巴甜响应稍高，但安塞蜜和糖精钠的响应较低，并且峰形对称性差；甲醇-甲酸铵-甲酸体系分离响应较好，故选择甲醇-甲酸铵-甲酸水溶液作为色谱流动相。

采取大梯度的洗脱方式，即起始为98%水相，在5 min内变化到20%水相，尽可能使各种化合物在较短的时间内分离。同时考察了流动相A和B的比例，试验发现，流动相A和B的比例改变对安赛蜜、糖精钠和甜蜜素的测定结果影响较小，在一定时间内均会出峰；但流动相A和B的比例不恰当会导致出现三氯蔗糖、阿斯巴甜和纽甜不出峰或峰形很差的情况。

2.1.2 离子化模式的优化

在优化的色谱条件下，对比了ESI+和ESI-两种模式对6种甜味剂质谱响应的影响。试验结果表明，纽甜、三氯蔗糖、阿斯巴甜在正、负模式下均有响应，且正模式的响应要比负模式强；糖精钠、甜蜜素、安赛蜜3种化合物在正模式下没有响应。考虑到正负离子模式频繁转换易造成仪器不稳定，而6种甜味剂在负模式下响应均能满足要求，故实验选择ESI-模式下检测6种甜味剂。

5)旅游设施和管理缺失。由于森林古道地理位置特殊，尤以海拔较高处管理相对薄弱，缺乏相应的旅游设施，游客上山所携带的食品包装成为随处可见的垃圾。部分游客在人文古迹上乱涂乱画，另有游客进行烧烤野炊等污染环境的行为。

2.1.3 传输电压的优化

传输电压是HPLC-TOF MS的一项关键参数，该参数对待测物的检测灵敏度和特征离子碎片信息的丰富程度有直接影响，因此需要优化传输电压以使目标化合物产生最大响应信号且生成较少的碎片离子。在其它优化条件下，着重考察从90 V到200 V的传输电压。随着电压增大，甜味剂的响应值逐渐升高，到达某一电压时最高；再升高电压时，响应值降低或不变，综合考虑选择140 V作为最佳传输电压。

2.2 HPLC-Q TOF MS定性分析

对样品进行全扫描，利用分子离子精确质量的理论值与测量值的质量偏差小于5×10-6及特征碎片离子对化合物进行定性。

在优化的色谱和质谱条件下对6种甜味剂进行分析，分子离子峰精确相对分子质量的理论值和测量值以及质量偏差列于表1。基于HPLC-Q TOF MS负离子扫描模式的6种甜味剂的分子特征离子提取色谱图见图1。

表1 各化合物母离子理论质荷比、实测质荷比及匹配结果

图1 6种甜味剂的提取离子色谱图

2.3 基质效应

基质是样品中被分析物以外的组分，常对分析物的分析有显著干扰，从而影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应［15］。为研究基质效应对测定结果的影响，取阴性果醋饮料、饮料及冰糖雪梨饮料按1.4实验方法处理，用得到的溶液配制成2.0 mg／L混合标准溶液，与纯水配制的2.0 mg／L的混合标准溶液进行比较。

式中：A——与基质相同体积纯水处理后加入相同量标准品所测得峰面积；

B——基质处理后加入相同量标准品所测得峰面积。

根据式(1)，除果醋中的甜蜜素测定值增大80.1%、麦芽汁发酵饮品中的阿斯巴甜测定值增大了21.7%外，其余甜味剂的基质效应值均在±10%以内，尤其是阴性的冰糖雪梨饮料，其基质效应值在±8%以内，说明阴性样品基质对样品检测的影响不大，因而在验证方法可行性时采用阴性样品提取液作为溶剂；而含有某种甜味剂的阳性样品中该甜味剂会影响检测结果。因此本方法最终采用基质匹配外标校准曲线对样品中的甜味剂进行定量，以抵消基质效应的影响。

2.4 线性方程

6种甜味剂在0.02～2.0 mg／L浓度范围内，标准溶液的质量浓度x与色谱峰面积y呈良好的线性关系(r≥0.998)，以6种甜味剂测量信噪比S／N=3时的进样浓度定义为检出限，结果列于表2。

表2 6种人工甜味剂的线性方程、相关系数及检出限

2.5 回收试验与精密度试验

通过向阴性饮料样品中添加低(0.1 mg／L)、中(0.5 mg／L)、高(1.0 mg／L)3个浓度水平的甜味剂混合标准溶液，进行回收试验和精密度试验，每个浓度样品平行测定5次，测定结果见表3。由表3可见，6种甜味剂的回收率在63.0%～113.2%之间，相对标准偏差为1.2%～9.6%。

表3 6种人工甜味剂的添加回收率、精密度

2.6 实际样品检测

采用Aglient 公司的质谱分析软件建立甜味剂的精确分子质量及Q TOF MS的数据库，应用本方法对市售果醋、麦芽汁发酵饮品、奶茶、山楂果肉饮料、荔枝汁饮料、白兰地、葡萄酒、白酒等进行检测，检测结果：果醋样品中含安赛蜜314.6 mg／L、甜蜜素204.7 mg／L、阿斯巴甜161.8 mg／L；麦芽汁发酵饮品中含安赛蜜14.1 mg／L、阿斯巴甜11.5 mg／L；其余样品均没有检出。

3 结语

建立了饮料中糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖6种人工合成甜味剂的高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱快速分析方法。样品经简单的前处理，利用四极杆-飞行时间质谱的精确质量定性实现化合物的定性。本方法简便快捷，灵敏度高，可满足国内外现行法规的限量要求。

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Analysis of 6 Synthetic Sweeteners in Beverage by Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

Yang Jun1，2, Wang Jianhua2, Liu Jingjing2, Li Li3, Yan Dongyun1
(1. Qingdao University, Qingdao 266071, China; 2. Shandong Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China; 3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

A new method was established for the determination of 6 synthetic sweeteners (sodium saccharin, cyclamate, acesulfame-K, aspartame, neotame, sucralose) in beverage, by using high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q TOF MS). The samples were extracted by water and measured directly by HPLC-Q TOF MS with electrospray ionization in negative mode. The compounds were separated by a C18column with methyl alcohol and 0.1% formic acid-10 mmol／L ammonium formate solution as the mobile phase. A detailed fragmentation study for 6 synthentic sweeteners was carried out by time of fl ight. The 6 compounds behave linearly in the range of 0.02-2.0 mg／L with the correlation coeff i cient of more than 0.998. The recoveries were 63.0%-113.2%, with coeff i cients of variation below 9.6%(n=5). The method is suitable for routine qualitative and quantitative analyses of synthetic sweeteners in beverage.

high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry; artificial sweeteners; screening; beverage

O657.7

A

1008-6145(2014)02-0009-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.02.003

*国家质检公益性行业科研项目（2012424012-2）

联系人：李立；Email: whywrs9@163.com

2013-03-08