地龙的定性鉴别及蛋白质含量测定

卓 燊 廖泽勇

地龙的定性鉴别及蛋白质含量测定

卓 燊2廖泽勇1

目的 对地龙进行定性鉴别及蛋白质含量测定。方法采用显微、薄层色谱法对地龙进行定性鉴别，采用紫外分光光度法对其蛋白质含量进行测定。结果蛋白质在0.02～0.10mg/m l范围内线性关系良好，在50min内稳定性良好，测得地龙蛋白质含量为2.33mg/g，仪器精密度RSD为0.627 %。结论利用显微及薄层鉴别，可对地龙药材进行定性鉴别及含量测定，蛋白质含量采用紫外测定方法简便可行。

地龙；定性鉴别；蛋白质；

地龙（Geosaurus）为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaas pergilum（E Perrier）、威廉环毛蚓P guillelmi（M ichaelsen）、栉肓毛蚓P pectinifera M ichaelsen或通俗环毛蚓P vulgarisChen的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称“泸地龙”，主产于福建、广东、广西等地；性寒，味咸；功效为清热定惊，平肝熄风，通络利尿平喘；用于关节麻痹，高热神昏，肢体麻木，惊痫抽搐，半身不遂，肺热喘咳等。

地龙化学成分种类繁多，结构复杂，多为高分子有机化合物[1-2]，主要化学成分为蛋白质类。蛋白质、氨基酸类成分可通过电泳分析、仪器分析等方法进行含量测定；而目前化学成分、药理等方面的研究相对较少。近年有研究使用地龙治疗支气管哮喘、癫痫发作、腮腺炎、高血压、消化性溃疡等而获效的报道，是中医药治疗心脑血管疾病、高热惊厥、支气管哮喘的良药[3]。

1 仪器与试剂

1.1 仪器HH-6恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）；显微镜BA-200（厦门麦克奥迪有限公司）；UV-紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；电子天平、离心机、KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂地龙（广州致信中药饮片有限公司）；地龙对照药材（昆明双星科技开发有限公司）；考马斯亮蓝G-250；牛血清白蛋白；试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 地龙的显微分析按照2010版中国药典的方法，将地龙药材进行粉碎处理，取少量粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛，加热透化，再滴加稀甘油装片，在显微镜（目镜6×，物镜40×）下观察，实验结果如图1。

地龙粉末呈灰黄色，显微镜实验结果：①刚毛呈黄棕色或淡棕色，前端多顿圆，表面或可见纵裂纹；②斜纹肌纤维，淡棕色或无色，散离或相互交结，弯曲或稍平直，边缘常不平整；③表皮黄棕色，细胞界限明显，暗棕色色素颗粒散在或聚成网状。

2.2 地龙的薄层分析

2.2.1 方法一 取地龙粉末 3g，加乙醇 30m l，水浴加热回流 30min，放冷滤过，滤液蒸干，残渣加水10m l使溶解，用石油醚15m l振摇萃取，分取石油醚层，置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇1m l使溶解，作为供试品溶液。另取地龙对照药材0.3g，加乙醇10m l，同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（9.0:0.5）为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸-乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，实验结果如图2所示。

2.2.2 方法二 取地龙粉末3g，加氯仿30m l，超声处理 3min，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加氯仿1m l溶解，作为供试品溶液。另取地龙对照药材0.3g，加氯仿10m l，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（9:1）为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸-乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检测，实验结果如图3～4所示。

图1 地龙粉末显微图

图2-4 10%硫酸-乙醇显色TLC图(温度：20℃，湿度：65%)

图2为供试品与对照药材在相应的位置上显相同紫红颜色的主斑点。图3～4在365nm紫外荧光检测下，供试品与对照药材在相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；10 %硫酸-乙醇溶液薄层板上，供试品与对照药材在相应位置上显相同颜色的斑点。

2.3 地龙的蛋白质检测取地龙粉末 3g，用冷水30m l浸提（每毫升含原药材100mg），适当浓缩后，取浸提液点样于硅胶 G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4:1:5）（上层）为展开剂，展开，取出晾干，喷以0.5%茚三酮溶液显色，实验结果如图5所示。

地龙薄层分析显紫红至深蓝斑点，表明地龙药材中含有大量蛋白质氨基酸类成分。

图5 0.5%茚三酮溶液显色TLC图

2.4 地龙的蛋白质含量测定

2.4.1 供试液的制备 称取地龙药材30g，加10倍量水，浸泡40min，煎煮3次，每次60min，过滤后合并滤液，将滤液浓缩至适量，放置过夜，离心，定容成50m l备用[4-5]。

2.4.2 对照品及试剂的配制 牛血清白蛋白标准液：称取50mg牛血清白蛋白，加50m l蒸馏水容成1mg/m l溶液。考马斯亮蓝 G-250蛋白试液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50m l 95%乙醇中，加入85%的磷酸100m l，用蒸馏水定容成1000m l[6]。

2.4.3 线性关系考察 在各试管中分别加入浓度为0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/m l的蛋白质溶液，再各加入5m lG-250试剂充分摇匀，放置2min后在595nm波长下测定吸光值。以标准蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线为 Y=4.8214X+0.0034，R2=0.9997，表明标准蛋白质在0.02～0.10mg/m l范围内线性关系良好（表1）。

表1 蛋白溶液标准曲线

2.4.4 精密度测定 精密吸取 0.6mg/m l的牛血清白蛋白溶液100μl，加入5m l G-250试剂充分摇匀，放置2min后在595nm波长下测定吸光值。连续测定6次。实验结果RSD为0.627%，表明仪器精密度良好（表2）。

2.4.5 稳定性考察 精密吸取0.6mg/m l的牛血清白蛋白溶液100μl，加入5m l G-250试剂充分摇匀，放置2min后在595nm波长下测定吸光值。每10min测一次，测定50min内的吸光度。实验结果RSD为2.57%，表明蛋白质溶液在50min内性质稳定（表3）。

表2 精密度测定

表3 稳定性考察

2.4.6 样品含量测定 于3支试管中分别准确加入已稀释10倍的0.1m l样品蛋白液，再各加5m l考马斯亮兰G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595nm波长下测定吸光值。计算得出蛋白质含量（表4）。

经样品含量测定，地龙水溶性蛋白质的含量（以牛血清白蛋白计）为2.33mg/g。

表4 样品含量测定结果

3 小结

本研究显示，利用显微鉴别法和薄层鉴别法可对地龙药材进行定性鉴别及含量测定，蛋白质含量采用紫外测定方法简便可行。

[1] Eue I,KausChke E,Mohrig W,et al.Isolation and character ization of earthworm Hemolysins and Agg Lutinins[J].Developmental & Comparative Immunology,1998,22(1):23-25.

[2] Kazuo K,Makoto Y,Masahiko O,et al.Perfo rin in earthw orm coelomocytes[J].Developmental & Comparative Immunology,1998, 22(1):133-134.

[3] 王本祥.现代中药药理学[M].天津:天津科学技术出版社,1997: 1104-1104.

[4] 高华宏,刘昌,王文琼,等.正交试验法优选广地龙提取工艺[J].湖北中医学院学报,2004,6(3):31-32.

[5] 李廷利,李玉萍,冯翰.地龙的化学成分与临床应用概况[J].黑龙江医药,2006,19(4):303-304.

[6] 邱葵,司天润.用考马斯亮蓝测定动物药材中可溶性蛋白质含量方法初探[J].中国中医药信息杂志,2007,14(4):49-50.

[7] 吕金胜,吴畏,孟德胜,等.地龙醇提物抗炎及镇痛作用的研究[J].中国药师,2003,6(1):16-18.

[8] 邓少伟,马双成.用大孔吸附树脂分离川芎总提物[J].中草药, 1999,30(1):23-24.

Qualitative Identification and Determ ination of Protein Content of Geosaurus

Zhuo Shen Liao Zeyong

Ob jec tive To do qua litative identification and determ ination of p rotein content of Geosaurus.MethodsWe used the m icroscopy、TLC and UV spectrophotometry methods to prove the identification and determ ine the p rotein o f Geosaurus.Resu ltThe p rotein was linear in the range of 0.02～0.10m g/m l.The stability of p rotein was fine in 50m in.The protein content of geosaurus was 2.33mg/g and RSD was 0.627%.Conc lusionUse of the methods of m icroscopy、TLC can identify Geosaurus.UV m ethods o f p rotein content o f Geosaurus is easy and feasib le.

Geosaurus;Qualitative Identification;Protein

R927.2

A

1673-5846(2014)05-0018-03

1广西药用植物园，广西南宁 530023

2广西科技大学医学院，广西柳州 545005

卓燊（1975-），主管中药师，硕士研究生，研究方向：中药药效与理论。

廖泽勇（1984-），初级研究员，硕士研究生，研究方向：中药药效学。