盐酸左氧氟沙星片微生物限度检测的方法学建立和验证

李趣嫦 朱欢敏 肖建光

盐酸左氧氟沙星片微生物限度检测的方法学建立和验证

李趣嫦 朱欢敏 肖建光

目的 建立了盐酸左氧氟沙星片微生物限度的检测方法，并对方法学进行验证。方法采用低速离心结合薄膜过滤手段建立盐酸左氧氟沙星片的微生物限度检测方法。结果细菌计数及控制菌用薄膜过滤法检查，霉菌及酵母菌计数用常规法检查。结论该方法准确、可靠，适用于左氧氟沙星片的微生物检查。

左氧氟沙星片；微生物限度；方法学；建立；验证

盐酸左氧氟沙星片适用于敏感细菌引起的轻、中度感染，主要用于呼吸道系统感染、泌尿系统感染、生殖系统感染、皮肤软组织感染、肠道感染、败血症、粒细胞减少及免疫功能低下患者和各种感染等，有抗菌谱广、抗菌作用强的特点。本文根据《中国药典》2010版[1]的要求，建立了盐酸左氧氟沙星片的微生物限度检查方法，并对方法学进行了验证。

1 仪器与试药

1.1 菌种金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC (B)63501]和白色念珠菌[CMCC(F)10123]均购自中国食品药品检定研究院；黑曲霉（ATCC16404）购自于广东省微生物研究所。

1.2 培养基营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，MUG培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基。

1.3 供试品盐酸左氧氟沙星片，批号：20111101、20120101、20120301，规格：0.1g，生产厂家：广东彼迪药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，置30～35℃培养18～24h；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m l含菌数为50～l00cfu的菌悬液。用于控制菌验证时配制成每1m l含菌数小于l00cfu的菌悬液。

2.1.2 白色念珠菌 取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，置23～28℃培养24～48h；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～l00cfu的菌悬液。

2.1.3 黑曲霉 取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，置23～28℃培养5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～l00cfu的孢子悬液。

2.2 供试液的制备取样品10g，加入pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪打碎，制成1:10供试液。

2.3 验证试验

2.3.1 霉菌及酵母菌计数 取1:10供试液1ml和试验菌液1ml注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。试验独立进行3次，见表1。可见平皿法3次试验，两株菌株的回收率均大于70%，故盐酸左氧氟沙星片的霉菌和酵母菌计数按平皿法检查。

表1 霉菌及酵母菌计数回收率测定结果(平皿法)(%)

2.3.2 细菌计数 方法一：取 1:10的供试液，以500r/min离心3min，分别各取上清液1ml，加至含0.1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中，摇匀，滤过，用含0.1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1000ml冲洗滤膜，每次 100ml。试验结果：大肠埃希菌菌株的回收率仅为 8%，故此方法并不适合作为细菌计数检查方法。方法二：取 1:10的供试液，以 500r/min离心3min，取上清液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:100的供试液。取1:100供试液1ml，加至45℃ pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中，摇匀，滤过，用45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液200ml冲洗滤膜，每次100ml。试验独立进行3次，由表2可见，薄膜过滤法3次试验，三株菌株的回收率均大于70%，故盐酸左氧氟沙星片的细菌计数采用薄膜过滤法检查。

表2 细菌计数回收率测定结果(方法二)(%)

2.4 控制菌检查法的验证方法一：取 1:10的供试液，以500r/min离心3min，取上清液5ml，加至45℃含0.1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中，摇匀，过滤，用45℃含0.1%聚山梨酯 80的 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1000ml分10次冲洗滤膜，在最后1次冲洗液中加入大肠埃希菌菌液 1ml，滤干，然后取出滤膜，平行做两份，取膜至800ml胆盐乳糖培养基中，按大肠埃希菌的检查法进行验证。由表3结果可知，本品对大肠埃希菌有较强的抑制作用，此方法不适合该品种的大肠埃希菌检查。方法二：取1:10的供试液，以 500r/min离心 3min，取上清液 5ml，加入45℃含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，摇匀，过滤，用45℃含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml冲洗滤膜，每次100ml，在最后1次冲洗液中加入大肠埃希菌菌液 1ml，滤干，然后取出滤膜，平行做两份，取膜至 1000ml的胆盐乳糖培养基中，按大肠埃希菌的检查法进行验证，见表3。

表3 控制菌验证结果

3 讨论

盐酸左氧氟沙星对大多数肠杆菌科细菌，如大肠埃希菌、沙门氏菌属、变形杆菌属等革兰阴性细菌有较强的抗菌活性，故将大肠埃希菌作为实验的敏感菌株。在细菌计数验证中，用1:10供试液，冲洗量为1000ml，大肠埃希菌的验证回收率无法达到70%以上。根据《中国药典》2010版[1]二部附录ⅪⅩP微生物限度检查法应用指导原则，“进行验证试验时，若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验”。因此本文拟用1:100供试液，用薄膜过滤法进行验证。

有文献报道[2]，硫酸锰中Mn2+作为二价金属离子可以和喹诺酮类抗生素发生络合反应，生成物无抑菌作用。但实验过程却发现硫酸锰会与胆盐乳糖培养基发生反应，产生浑浊或生成絮状沉淀的现象，直接降低培养基的营养成份。本文采用薄膜过滤法及培养基稀释法能很好地消除本品的抑菌性，方法简便可行，重复性好。

[1] 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:附录ⅩⅠⅩ.

[2] 刘涛,朱斌,韦涛,等.氧氟沙星栓微生物限度检查方法探讨[J].临床合理用药,2010,3(20):4-5.

Development and Validation of a M icrobial Lim it test M ethod for Levofloxacin Hydrochloride tablets

Li Quchang Zhu Huanm in Xiao Jianguang

Ob jec tiveTo deve lop and va lidate a m ethod for m icrobial lim it detection o f levofloxacin hydrochloride tablets.MethodsLow-speed centrifugation and m em brane filtration app roaches were used for the development o f m icrobial lim it detection method for levofloxacin hydrochloride tablets.Resu ltsThe bacteriad and the control of bacteria were determ ined by m embrane filtration app roach,m o lds and yeast were determ ined by routine app roach.Conc lusionThe method is accurate,re liab le,and suitab le for detection of the m icrobia l lim it of levo floxacin hydrochloride tablets.

Levo floxacin tablets;M icrobia l lim it detection;Method;Developm ent;Va lidation

R927.11

A

1673-5846(2014)05-0016-02

广东省食品药品检验所微生物室，广东广州 510180

李趣嫦（1982 -），学士，主管药师。研究方向：药物分析。E-mail：liquchang@sohu.com。