人附红细胞体感染小鼠外周血白细胞凋亡的研究

赵晓辉++++++韩子强

[摘要] 目的 了解人附红细胞体感染对小鼠白细胞凋亡的影响。方法 用流式细胞仪对白细胞凋亡以及CD4+ 和CD8+ T 淋巴细胞亚群的动态变化规律进行检测。结果 感染后CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞比例下降，CD4+ T 淋巴细胞比例在感染后第3天和第5天分别由感染前的12.89% 下降到10.83% 和6.34%，CD8+ T 淋巴细胞比例由感染前的8.31% 分别下降到6.16%和4.32%。白细胞凋亡的检测显示， 感染初期感染组凋亡细胞显著高于对照组。结论 人附红细胞体诱导细胞凋亡是导致免疫抑制和免疫细胞减少的主要原因。

[关键词] 人附红细胞体；小鼠； 白细胞； 细胞凋亡

[中图分类号] R725；S858.28 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）13-0007-03

附红细胞体（Eperythrozoon）是寄生于红细胞表面、血浆及骨髓中的一群微生物，能导致人和动物的附红细胞体病（Eperythrozoonosis）。自1928年Schilling和Dinger 等分别在啮齿类动物中查到该病原体后，迄今全世界已有30多个国家和地区对此报道。近几年，学者主要对附红细胞体所寄生的红细胞及红细胞免疫学方面研究较多[1]，而未发现有关人附红细胞体对白细胞影响变化的报道。为了解人附红细胞体感染后宿主机体免疫情况的变化，本实验对人附红细胞体感染小鼠后外周血白细胞变化、白细胞凋亡的变化及CD4+和CD8+T 淋巴细胞亚群变化进行检测，为进一步研究人附红细胞体感染人群附红细胞体病提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

SPF级BALB/c小鼠，购自泰山医学院实验动物中心，共36只，雌雄各半，6～8周龄，体重22～24 g。人附红细胞体阳性血液通过医院确诊的人附红细胞体感染阳性的患者采取；从美国罗氏公司购买的ACTGene Annex in V-FITC细胞凋亡试剂盒；从美国BD公司购买的用荧光标记的CD3+、CD4+和CD8+单克隆抗体。

1.2 样品采集

将36只小鼠随机分为实验组和对照组，每组18只，隔离饲养。实验组经腹腔接种附红细胞体悬液0.5 mL/只，对照组经腹腔接种生理盐水0.5 mL/只，分别于感染第1、3、5、7、9天经心脏取血，肝素抗凝。

1.3 外周血白细胞及白细胞凋亡检测

采集的抗凝血用BC-2000血液细胞分析仪检测白细胞总数量。根据细胞凋亡试剂盒说明书使用程序，用Annex in V-FITC和PI双试剂对白细胞进行染色，通过流式细胞仪双通道检测荧光信号[2]。

1.4 CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群检测

按照检测试剂和仪器说明书，应用流式细胞术检测。取肝素抗凝血样本100 μL分别加入CD3+、CD4+和CD3+、CD8+单克隆抗体对照10 μL，室温避光孵育30 min，加入溶血素溶解红细胞后，1500转/min，离心5 min， 弃上清，用PBS 重新悬浮细胞，过滤网过滤样本后上机检测[3-4]。

1.5 统计学方法

应用SPSS13.0软件包进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白细胞总数的变化

感染后实验组小鼠外周白细胞总数量显著减少，白细胞总数量平均值由感染前的4.95×109/L，下降到感染后第5天的3.27×109/L，与感染前比较差异显著（P<0.05）。感染后第9天减少至2.89×109/L，仅为感染前的白细胞总数的58.4%，与感染前比较，差异显著（图1）。对照组白细胞总数在实验前后没有明显变化。

图1 人附红细胞体感染小鼠白细胞总数的变化

2.2 白细胞凋亡的变化

对实验组和对照组小鼠白细胞进行凋亡检测，实验组在感染后第3天和第5天，小鼠白细胞凋亡的比例显著高于对照组，特别是在第5天，实验组小鼠白细胞凋亡数占细胞总数平均值8.17%，对照组小鼠白细胞凋亡数平均值1.2%，差异有统计学意义（P<0.05）。在第7、9天，实验组与对照组白细胞调亡数白细胞总数比较不显著。

2.3 CD4+、CD8+ T淋巴细胞的变化

分别在感染后第3、5、7、9天采集外周血，检测小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞的变化。结果是感染前实验组小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞数占T淋巴细胞总数的百分比分别为12.89%和8.31%，感染后百分比逐渐降低。在第3天，CD4+、CD8+ T淋巴细胞显著减少，分别下降到10.83%和6.16%；感染后第5天，分别为6.34%和4.32%。但在感染后第7天，CD4+、CD8+ T淋巴细胞比例上升，到第9天，分别为6.54%和4.78%（图2）。

图2 人附红细胞体感染小鼠CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的变化

3 讨论

附红细胞体病是一种新型人兽共患性疾病，动物方面的流行报道及相关研究居多，而关于人附红细胞体的感染报道及研究较少。据王柯棣[5]等报道人附红细胞体在全国广泛流行，包括不同地域的城市和农村都有报道[6-7]。不同地域的感染率都不同，有的地方人群的感染率达到了40%以上，应引起当地部门重视。相对人附红细胞体病的探索也仅仅在诊断方式、临床治疗药物等应用性临床研究。关于在附红细胞体病的分类、不同宿主附红细胞体的感染途径及生物学特征以及对机体免疫系统的影响等方面还没有明确的报道[8]。本实验在前期的研究基础上，对人附红细胞体感染小鼠白细胞研究具有重要参考意义。

通过实验，我们发现人附红细胞体感染小鼠引起外周白细胞数量减少，与大部分细菌感染机体后，导致炎症发生，引起白细胞增多情况不同。根据流行病学调查，人群中附红细胞体感染大多不表现临床症状，没有炎症的发生，只有在免疫力降低或者患慢性消耗性疾病时，才发生感染发病[9]，具有机会致病菌的的特点。由于该微生物附在红细胞上或者游离在血液中，学者们对红细胞体免疫研究较多，而对附红细胞体与白细胞关系研究很少，因此人附红细胞体感染导致白细胞减少与感染疾病的相关性还需要进一步研究。

本次我们采用流式细胞仪分析在人附红细胞体感染后，小鼠外周CD4+、CD8+ T淋巴细胞和白细胞凋亡变化，首次描述了人附红细胞体感染后外周血免疫细胞的消长变化情况。本实验使用Annexin-V-FITC-PI 双标法，能很好分开活细胞、坏死细胞及凋亡细胞。本实验结果显示，白细胞凋亡在人附红细胞体感染后前5天，凋亡比例逐渐增加，而在第7、9天凋亡数与对照组相比较差异并不显著。白细胞凋亡过程是生化变化、基因调控、细胞信号转导及酶激活等多方面作用的结果， 受多因子调节， 其机制目前还不太清楚。迄今为止，人附红细胞体感染导致外周白细胞凋亡研究未见报道，是否与其诱导或抑制原癌基因bc1-2及其相关基因有关，还需要进一步研究。杨朋艳等[10]报道，猪附红细胞体感染小鼠后淋巴细胞总数显著减少，另据杨蕾芳等[11]报道TH17细胞可能在附红细胞体染过程中发挥了一定的免疫调节，而赵里等[12]报道树突状细胞可能发挥了负性调节作用。本实验测定人红细胞体感染后，CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群显著减少，由此可推断人附红细胞体感染诱导的白细胞及T淋巴细胞减少可能导致感染初期机体的免疫抑制，从而为人附红细胞体感染机体的免疫学研究提供数据。

[参考文献]

[1] 李国兰，杨玉芝，郭岭，等. 附红细胞体研究进展[J]. 中国病原生物学杂志，2008，3（8）：629-630.

[2] 杨汉春. 动物免疫学[M]. 第2版.北京：中国农业大学出版社，2003：371-373.

[3] 郑敏，熊娟，赵骥. 大蒜多糖C对正常小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响[J]. 咸宁学院学报（医学版），2007，21（1）：9-12.

[4] 张洋，朱宝芹，阎国辉，等. 三种小鼠外周血淋巴细胞亚群正常值比较[J]. 中国比较医学杂志，2007，17（8）：12-15.

[5] 王柯棣，王章云. 附红细胞体病研究进展[J]. 教育教学论坛，2012，37：29-31.

[6] 文海蓉，熊丽，吴景文，等. 南昌地区人体附红细胞体流行病学调查[J]. 现代预防医学，2012，39（17）：4361-4362.

[7] 石泉贵，李素芝，陈洪章. 高原人附红细胞体研究概况[J]. 国际检验医学杂志，2012，33（20）：2452-2455.

[8] 司唯，姚琳，贾立军，等. 猪附红细胞体感染途径研究[J]. 动物医学进展，2012，33（12）：85-87.

[9] 尚德秋，陆光宇. 附红细胞体感染人畜的流行病学调查（Ⅲ）[J]. 中华流行病学杂志，1997，17（3）：150-152.

[10] 杨朋艳，梁晚枫，张守发. 猪附红细胞体感染BALB/c小鼠试验研究[J]. 中国农学通报，2012，28（23）：69-72.

[11] 杨蕾芳，巴彩凤. 流式细胞术检测小鼠感染附红细胞体后TH17细胞的表达[J]. 中国人兽共患病学报，2012， 28（4）：347-350.

[12] 赵里，单思，巴彩凤. 猪附红细胞体对树突状细胞成熟的影响研究[J]. 中国农学通，2013，29（32）：58-62.

（收稿日期：2014-02-25）

本次我们采用流式细胞仪分析在人附红细胞体感染后，小鼠外周CD4+、CD8+ T淋巴细胞和白细胞凋亡变化，首次描述了人附红细胞体感染后外周血免疫细胞的消长变化情况。本实验使用Annexin-V-FITC-PI 双标法，能很好分开活细胞、坏死细胞及凋亡细胞。本实验结果显示，白细胞凋亡在人附红细胞体感染后前5天，凋亡比例逐渐增加，而在第7、9天凋亡数与对照组相比较差异并不显著。白细胞凋亡过程是生化变化、基因调控、细胞信号转导及酶激活等多方面作用的结果， 受多因子调节， 其机制目前还不太清楚。迄今为止，人附红细胞体感染导致外周白细胞凋亡研究未见报道，是否与其诱导或抑制原癌基因bc1-2及其相关基因有关，还需要进一步研究。杨朋艳等[10]报道，猪附红细胞体感染小鼠后淋巴细胞总数显著减少，另据杨蕾芳等[11]报道TH17细胞可能在附红细胞体染过程中发挥了一定的免疫调节，而赵里等[12]报道树突状细胞可能发挥了负性调节作用。本实验测定人红细胞体感染后，CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群显著减少，由此可推断人附红细胞体感染诱导的白细胞及T淋巴细胞减少可能导致感染初期机体的免疫抑制，从而为人附红细胞体感染机体的免疫学研究提供数据。

[参考文献]

[1] 李国兰，杨玉芝，郭岭，等. 附红细胞体研究进展[J]. 中国病原生物学杂志，2008，3（8）：629-630.

[2] 杨汉春. 动物免疫学[M]. 第2版.北京：中国农业大学出版社，2003：371-373.

[3] 郑敏，熊娟，赵骥. 大蒜多糖C对正常小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响[J]. 咸宁学院学报（医学版），2007，21（1）：9-12.

[4] 张洋，朱宝芹，阎国辉，等. 三种小鼠外周血淋巴细胞亚群正常值比较[J]. 中国比较医学杂志，2007，17（8）：12-15.

[5] 王柯棣，王章云. 附红细胞体病研究进展[J]. 教育教学论坛，2012，37：29-31.

[6] 文海蓉，熊丽，吴景文，等. 南昌地区人体附红细胞体流行病学调查[J]. 现代预防医学，2012，39（17）：4361-4362.

[7] 石泉贵，李素芝，陈洪章. 高原人附红细胞体研究概况[J]. 国际检验医学杂志，2012，33（20）：2452-2455.

[8] 司唯，姚琳，贾立军，等. 猪附红细胞体感染途径研究[J]. 动物医学进展，2012，33（12）：85-87.

[9] 尚德秋，陆光宇. 附红细胞体感染人畜的流行病学调查（Ⅲ）[J]. 中华流行病学杂志，1997，17（3）：150-152.

[10] 杨朋艳，梁晚枫，张守发. 猪附红细胞体感染BALB/c小鼠试验研究[J]. 中国农学通报，2012，28（23）：69-72.

[11] 杨蕾芳，巴彩凤. 流式细胞术检测小鼠感染附红细胞体后TH17细胞的表达[J]. 中国人兽共患病学报，2012， 28（4）：347-350.

[12] 赵里，单思，巴彩凤. 猪附红细胞体对树突状细胞成熟的影响研究[J]. 中国农学通，2013，29（32）：58-62.

（收稿日期：2014-02-25）

本次我们采用流式细胞仪分析在人附红细胞体感染后，小鼠外周CD4+、CD8+ T淋巴细胞和白细胞凋亡变化，首次描述了人附红细胞体感染后外周血免疫细胞的消长变化情况。本实验使用Annexin-V-FITC-PI 双标法，能很好分开活细胞、坏死细胞及凋亡细胞。本实验结果显示，白细胞凋亡在人附红细胞体感染后前5天，凋亡比例逐渐增加，而在第7、9天凋亡数与对照组相比较差异并不显著。白细胞凋亡过程是生化变化、基因调控、细胞信号转导及酶激活等多方面作用的结果， 受多因子调节， 其机制目前还不太清楚。迄今为止，人附红细胞体感染导致外周白细胞凋亡研究未见报道，是否与其诱导或抑制原癌基因bc1-2及其相关基因有关，还需要进一步研究。杨朋艳等[10]报道，猪附红细胞体感染小鼠后淋巴细胞总数显著减少，另据杨蕾芳等[11]报道TH17细胞可能在附红细胞体染过程中发挥了一定的免疫调节，而赵里等[12]报道树突状细胞可能发挥了负性调节作用。本实验测定人红细胞体感染后，CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群显著减少，由此可推断人附红细胞体感染诱导的白细胞及T淋巴细胞减少可能导致感染初期机体的免疫抑制，从而为人附红细胞体感染机体的免疫学研究提供数据。

[参考文献]

[1] 李国兰，杨玉芝，郭岭，等. 附红细胞体研究进展[J]. 中国病原生物学杂志，2008，3（8）：629-630.

[2] 杨汉春. 动物免疫学[M]. 第2版.北京：中国农业大学出版社，2003：371-373.

[3] 郑敏，熊娟，赵骥. 大蒜多糖C对正常小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响[J]. 咸宁学院学报（医学版），2007，21（1）：9-12.

[4] 张洋，朱宝芹，阎国辉，等. 三种小鼠外周血淋巴细胞亚群正常值比较[J]. 中国比较医学杂志，2007，17（8）：12-15.

[5] 王柯棣，王章云. 附红细胞体病研究进展[J]. 教育教学论坛，2012，37：29-31.

[6] 文海蓉，熊丽，吴景文，等. 南昌地区人体附红细胞体流行病学调查[J]. 现代预防医学，2012，39（17）：4361-4362.

[7] 石泉贵，李素芝，陈洪章. 高原人附红细胞体研究概况[J]. 国际检验医学杂志，2012，33（20）：2452-2455.

[8] 司唯，姚琳，贾立军，等. 猪附红细胞体感染途径研究[J]. 动物医学进展，2012，33（12）：85-87.

[9] 尚德秋，陆光宇. 附红细胞体感染人畜的流行病学调查（Ⅲ）[J]. 中华流行病学杂志，1997，17（3）：150-152.

[10] 杨朋艳，梁晚枫，张守发. 猪附红细胞体感染BALB/c小鼠试验研究[J]. 中国农学通报，2012，28（23）：69-72.

[11] 杨蕾芳，巴彩凤. 流式细胞术检测小鼠感染附红细胞体后TH17细胞的表达[J]. 中国人兽共患病学报，2012， 28（4）：347-350.

[12] 赵里，单思，巴彩凤. 猪附红细胞体对树突状细胞成熟的影响研究[J]. 中国农学通，2013，29（32）：58-62.

（收稿日期：2014-02-25）