腺病毒介导的SOCS3对银屑病小鼠模型治疗的实验研究

曾凡杞++++++廖明++++++张志云++++++李永双++++++胡波+++++刘梦琼

[摘要] 目的 研究腺病毒介导的SOCS3对银屑病小鼠模型的治疗作用。方法 获得重组腺病毒Ad-SOCS3，用Western Blot分析Ad-SOCS3在TC-1细胞中的表达，用流式细胞仪检测对TC-1的细胞凋亡。腹腔注射Ad-SOCS3小鼠银屑病模型，观察小鼠阴道上皮有丝分裂，用ELISA检测血清中IL-6和TNF-α浓度。 结果 SOCS3在TC-1能有效表达，与Ad-SOCS3的感染复数相关。Ad-SOCS3能显著抑制TNF-α介导的细胞凋亡（P<0.01）。Ad-SOCS3能抑制雌激素期小鼠阴道上皮有丝分裂（P<0.01），较Ad-EGFP，Ad-SOCS3降低血清中IL-6和TNF-α浓度（P<0.01）。结论 Ad-SOCS3能抑制炎性因子诱导的细胞凋亡和炎症，其对银屑病具有潜在的治疗价值。

[关键词] 腺病毒；细胞信号抑制因子3；银屑病

[中图分类号] R275.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）13-0004-03

银屑病是一个免疫介导的常见红斑鳞屑性疾病，发病率近1%～3%，表皮异常增殖和慢性炎症为其主要特征[1]。临床和实验证据表明前炎症细胞因子IFN-α（Interferon-α，干扰素-α）、IL-6（Interleukin-6，白细胞介数-6）在银屑病的发病过程中有重要作用[2]。细胞因子信号的抑制因子3（SOCS3）是重要的细胞内细胞因子活化的负调控因子，其机制是SOCS 蛋白直接结合细胞因子受体或JAKs的催化结构域，抑制STAT蛋白的招募和磷酸化或靶向受体复合物的泛素化和蛋白酶介导的降解[3]，这与银屑病的发生、发展密切相关。 2012年1月～2013年1月，我们采用Bonder和Van Scott[4]提出的雌激素期小鼠阴道上皮模型，模拟了银屑病的主要病理生理特点，复制缺陷型腺病毒SOCS3，观察其对银屑病模型雌激素期小鼠阴道上皮有丝分裂的影响，探讨SOCS3在治疗银屑病中的潜在作用和机制。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞系

C57BL/6 雌性小鼠，6～8周龄，购自广东省省实验动物中心。TC-1细胞系购自武汉大学典藏物种保存中心。TC-1用含10% 胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基（Gibco 公司）培养，细胞培养按常规方法进行。

1.2 腺病毒载体

重组腺病毒Ad-SOCS3、Ad-EGFP均由清华大学深圳研究生院郑义博士惠赠。即从C57BL/6的小鼠肝组织用Trizol RNA提取试剂盒（Introgen Company）提取RNA，RT-PCR得到SOCS3的基因，将该基因克隆到pShuttle2 载体，测序正确后，用I-CeuI/PI-SceI-消化 pshuttle2-SOCS3，然后插入复制缺陷腺病毒载体pAdeno-X vector。为了产生病毒，用PacI消化pAd-SOCS1，对质粒纯化后用lipofectamine 2000（Invitrogen）转染，在293T细胞收获病毒。Ad-EGFP的克隆方法和病毒产生同Ad-SOCS3类似。病毒的纯化用氯化铯梯度离心，纯化的病毒用含10 mM Tris-HCl （pH 7.5），1 mM MgCl2，和 10% 甘油的透析液透析，保存在-80 °C。用Adeno-X Rapid Titer kit （BD Clontech）检测病毒滴度（操作按试剂盒说明书进行，BD Company）。

1.3 重组腺病毒感染TC-1

将1×106 个 TC-1细胞接种到6孔细胞培养板，分别用PBS、Ad-EGFP、感染复数（MOI）为25和50的重组腺病毒Ad-SOCS3感染，用Western Blot检测SOCS3的表达，细胞用细胞裂解液（0.3% NP40，1 mM EDTA，50 mM Tris-Cl（pH 7.4），2 mM EGTA，1% Triton X-100，150 mM NaCl，25 mM NaF，1 mM Na3VO3，10 μg/mL PMSF）裂解细胞，按常规的Western blot操作方法进行，SOCS3和β-actin的一抗为鼠单抗（购自Santa Cruz公司，美国），TBS液洗涤后加入标记辣根过氧化物酶（HRP）的二抗孵育，再用TBS洗3次，用ECL显色液（深圳市纳诺美生物科技有限公司）显影、曝光、分析。

1.4 细胞凋亡的检测

TC-1细胞以每孔2×105个细胞接种于12孔细胞培养板孵育过夜，然后分别以PBS、Ad-SOCS3和Ad-EGFP感染细胞，病毒的感染复数为50，24 h后，再加入TNF-α（10 ng/mL），再培养24 h进行检测，采用流式细胞术，应用Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂（南京凯基生物科技发展有限公司提供）检测细胞凋亡。

1.5 重组腺病毒对雌激素期小鼠阴道上皮有丝分裂模型的影响

取雌性小鼠30只，腹腔注射己烯雌酚（广州白云山明兴制药有限公司，批号051001，规格2 mg/mL）0.2 mg/只，每日1次，连续3 d，使小鼠处于雌激素期。第4天将小鼠随机分为Ad-SOCS3组、Ad-EGFP组和生理盐水组，分别经腹腔注射200 μL的病毒滴度为109 Pfu/mL的重组Ad-SCOS3、Ad- EGFP和生理盐水注入小鼠，2 d后再腹腔注射一次，3 d后，各组小鼠腹腔注射秋水仙碱 （秋水仙碱原粉，国药集团化学试剂有限公司，批号WS20060329）15 mg/kg，使细胞有丝分裂周期停滞于有丝分裂中期，便于计数。5 h后取阴道标本，应用10%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，用光学显微镜观察有丝分裂情况，计数300个基底细胞中的有丝分裂数，计数有丝分裂指数（每100个基底细胞中的有丝分裂数）。

1.6 统计学分析

计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS17.0软件包分析处理，计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，多组间进行方差分析，采用F检验， P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 腺病毒对TC-1表达SOCS3的影响

从图1可以看出腺病毒Ad-SOCS3能够在TC-1细胞中表达，且与感染复数有关，感染复数越大，SOCS3的表达越强。 另外，腺病毒Ad-EGFP也能诱导SOCS3的表达，可能是Ad-EGFP感染细胞后反馈引起SOCS3的增加。

图1 Western Blot分析腺病毒感染TC-1后SOCS3的表达。Ad-S3（25）表示Ad-SOCS3，括号中的25表示MOI为25，Ad-S3（50）表示MOI为50的腺病毒Ad-SOCS3

2.2重组腺病毒Ad-SOCS3对TNF-α诱导的细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，PBS处理组的TC-1细胞凋亡率为13.7%，Ad-EFGP组在TNF-α诱导下，细胞凋亡率为19.2%，而Ad-SOCS3组细胞凋亡率为6.5%。与PBS组、Ad-EFGP组比较，Ad-SOCS3组TNF-α诱导的细胞凋亡明显降低（χ2=13.25、19.47，P<0.01），而Ad-EFGP 组和PBS组的细胞凋亡率无显著性差异（χ2=1.24，P>0.05）（图2），表明Ad-SOCS3可明显抑制TNF-α诱导的细胞凋亡。

[参考文献]

[1] Boyman O，Conrad C，Tonel G，et al. The pathogenic role of tissue resident immune cells in psoriasis[J]. Trends Immunol，2007，28（2）：51-57.

[2] Ueyama A，Yamamoto M，Tsujii K，et al. Mechanism of pathogenesis of imiquimod-induced skin inflammation in the mouse：A role for interferon-alpha in dendritic cell activation by imiquimod[J]. J Dermatol， 2014，41（2）：135-143.

[3] Baker BJ，Akhtar LN，Benveniste EN. SOCS1 and SOCS3 in the control of CNS immunity[J]. Trends in Immunology，2009，30（8）：392-400.

[4] Bonder RH，Van Scott EJ. Use of mouse vaginal and rect al epithelium to screen ant imitot ic ef fect of systemically administered dreg[J]. Cancer Res，1971，31（6）： 851- 853.

[5] Stahl A，Joyal JS，Chen J，et al. SOCS3 is an endogenous inhibitor of pathologic angiogenesis[J]. Blood，2012，120（14）：2925-2929.

[6] Joao Antonio Chaves de Souza，Andressa Vilas Boas Nogueira，Pedro Paulo Chaves de Souza，et al. SOCS3 expression correlates with severity of inflammation，expression of proinflammatory cytokines，and activation of STAT3 and p38 MAPK in LPS-induced inflammation in vivo[J]. Mediators of Inlammation，2013，10：1155.

[7] S Madonna S，Scarponi C，Pallotta s，et al. Anti-apoptotic effects of suppressor of cytokine signaling 3 and 1 in psoriasis[J]. Cell Death and Disease，2012，28（3），e334.

[8] Karsten KW，Woetmann A，Skov L，et al. Deficient SOCS3 and SHP-1 expression in psoriatic T cells[J]. J Invest Dermatol，2010，130（6）：1590-1597.

[9] Koppikar P，Bhagwat N，Kilpivaara O，et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy[J]. Nature，2012，489（7414）：155-159.

[10] Boyle K，Zhang JG，Nicholson SE，et al. Deletion of the SOCS box of suppressor of cytokine signaling 3（SOCS3） in embryonic stem cells reveals SOCS box-dependent regulation of JAK but not STAT phosphorylation[J]. Cell Signal 2009，21（3）：394-404.

[11] Inagaki-Ohara K， Kondo T，Ito M，et al. SOCS， inflammation， and cancer[J]. JAK-STAT，2013，2（3）：e24053.

（收稿日期：2013-11-20）

1.6 统计学分析

计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS17.0软件包分析处理，计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，多组间进行方差分析，采用F检验， P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 腺病毒对TC-1表达SOCS3的影响

从图1可以看出腺病毒Ad-SOCS3能够在TC-1细胞中表达，且与感染复数有关，感染复数越大，SOCS3的表达越强。 另外，腺病毒Ad-EGFP也能诱导SOCS3的表达，可能是Ad-EGFP感染细胞后反馈引起SOCS3的增加。

图1 Western Blot分析腺病毒感染TC-1后SOCS3的表达。Ad-S3（25）表示Ad-SOCS3，括号中的25表示MOI为25，Ad-S3（50）表示MOI为50的腺病毒Ad-SOCS3

2.2重组腺病毒Ad-SOCS3对TNF-α诱导的细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，PBS处理组的TC-1细胞凋亡率为13.7%，Ad-EFGP组在TNF-α诱导下，细胞凋亡率为19.2%，而Ad-SOCS3组细胞凋亡率为6.5%。与PBS组、Ad-EFGP组比较，Ad-SOCS3组TNF-α诱导的细胞凋亡明显降低（χ2=13.25、19.47，P<0.01），而Ad-EFGP 组和PBS组的细胞凋亡率无显著性差异（χ2=1.24，P>0.05）（图2），表明Ad-SOCS3可明显抑制TNF-α诱导的细胞凋亡。

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[11] Inagaki-Ohara K， Kondo T，Ito M，et al. SOCS， inflammation， and cancer[J]. JAK-STAT，2013，2（3）：e24053.

（收稿日期：2013-11-20）

1.6 统计学分析

计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS17.0软件包分析处理，计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，多组间进行方差分析，采用F检验， P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 腺病毒对TC-1表达SOCS3的影响

从图1可以看出腺病毒Ad-SOCS3能够在TC-1细胞中表达，且与感染复数有关，感染复数越大，SOCS3的表达越强。 另外，腺病毒Ad-EGFP也能诱导SOCS3的表达，可能是Ad-EGFP感染细胞后反馈引起SOCS3的增加。

图1 Western Blot分析腺病毒感染TC-1后SOCS3的表达。Ad-S3（25）表示Ad-SOCS3，括号中的25表示MOI为25，Ad-S3（50）表示MOI为50的腺病毒Ad-SOCS3

2.2重组腺病毒Ad-SOCS3对TNF-α诱导的细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，PBS处理组的TC-1细胞凋亡率为13.7%，Ad-EFGP组在TNF-α诱导下，细胞凋亡率为19.2%，而Ad-SOCS3组细胞凋亡率为6.5%。与PBS组、Ad-EFGP组比较，Ad-SOCS3组TNF-α诱导的细胞凋亡明显降低（χ2=13.25、19.47，P<0.01），而Ad-EFGP 组和PBS组的细胞凋亡率无显著性差异（χ2=1.24，P>0.05）（图2），表明Ad-SOCS3可明显抑制TNF-α诱导的细胞凋亡。

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[5] Stahl A，Joyal JS，Chen J，et al. SOCS3 is an endogenous inhibitor of pathologic angiogenesis[J]. Blood，2012，120（14）：2925-2929.

[6] Joao Antonio Chaves de Souza，Andressa Vilas Boas Nogueira，Pedro Paulo Chaves de Souza，et al. SOCS3 expression correlates with severity of inflammation，expression of proinflammatory cytokines，and activation of STAT3 and p38 MAPK in LPS-induced inflammation in vivo[J]. Mediators of Inlammation，2013，10：1155.

[7] S Madonna S，Scarponi C，Pallotta s，et al. Anti-apoptotic effects of suppressor of cytokine signaling 3 and 1 in psoriasis[J]. Cell Death and Disease，2012，28（3），e334.

[8] Karsten KW，Woetmann A，Skov L，et al. Deficient SOCS3 and SHP-1 expression in psoriatic T cells[J]. J Invest Dermatol，2010，130（6）：1590-1597.

[9] Koppikar P，Bhagwat N，Kilpivaara O，et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy[J]. Nature，2012，489（7414）：155-159.

[10] Boyle K，Zhang JG，Nicholson SE，et al. Deletion of the SOCS box of suppressor of cytokine signaling 3（SOCS3） in embryonic stem cells reveals SOCS box-dependent regulation of JAK but not STAT phosphorylation[J]. Cell Signal 2009，21（3）：394-404.

[11] Inagaki-Ohara K， Kondo T，Ito M，et al. SOCS， inflammation， and cancer[J]. JAK-STAT，2013，2（3）：e24053.

（收稿日期：2013-11-20）