菜豆植物凝集素对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响

牟龙妹，刘宜子，李佳楠

（江汉大学生命科学学院生物技术系，湖北武汉430056）

菜豆植物凝集素对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响

牟龙妹，刘宜子，李佳楠*

（江汉大学生命科学学院生物技术系，湖北武汉430056）

目的分析不同品种菜豆植物凝集素对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响，明确其生物安全性。方法小鼠腹腔注射3个品种菜豆凝集素，6 d后取小鼠骨髓细胞，吉姆萨染色，光学显微镜下观察小鼠骨髓细胞的微核发生情况并进行微核发生率的统计，进而判断不同种类菜豆植物凝集素是否具有致突变作用。结果实验组3个品种的菜豆植物凝集素引起的小鼠微核发生率与阴性对照组比较差异均无统计学意义，而阳性对照组与实验组及阴性对照组间差异有统计学意义（P＜0.05）；小鼠骨髓细胞微核发生率与菜豆植物凝集素呈剂量—反应关系，但与小鼠性别无关。结论3个含量分别为高、中、低水平的菜豆植物凝集素对小鼠骨髓细胞均无致突变作用，可进一步用于有关药物和生物制剂的开发应用。

菜豆；植物凝集素；微核试验；致突变作用

凝集素是能够识别和结合微生物或昆虫及哺乳动物消化道中的糖复合物的植物蛋白［1］，具有只对某一种特异性糖基专一性结合的特点［2］，且具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合而不影响其生物活性，可用于免疫细胞化学的研究［3-4］。微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法，最常用的是啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞（polychromatic erythro⁃cyte，PCE）微核试验。如果与对照组比较，处理组PCE微核率有统计学意义的增加，并有剂量—反应关系，则可认为该受试物是哺乳动物体细胞的致突变物［5-6］。用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤是一个有效可行的方法，在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用。

在前期研究中，笔者已经对56个品种的菜豆植物凝集素进行了活性浓度测定，并成功分离纯化到菜豆植物凝集素，本研究拟通过小鼠骨髓细胞微核试验对已分离的菜豆植物凝集素进行检测，判断其是否具有致突变作用，为菜豆植物凝集素的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物

昆明小鼠40只，体重（20±2）g，来自江汉大学动物中心，实验动物的饲养环境温度控制在18～25℃。自由采食、饮水。

1.2 鲜材与试剂

菜豆鲜荚由江汉大学湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心试验基地提供。本实验样品均为2014年春季栽植。本实验选取菜豆开花后15 d的成熟商品荚作为研究对象，共计3个品种（见图1）。硫酸铵、甘油、甲醇、吉姆氏（Giemsa）色素、环磷酰胺（CP）、丙三醇、磷酸缓冲液、带油镜镜头显微镜、细胞计数板。

图1 供试菜豆品种及其凝集素含量Fig.1Kidney bean varieties and lectin content

1.3 方法

1.3.1 菜豆植物凝集素的制备将新鲜菜豆豆荚打碎成浆后，称取匀浆10 g，加入PBS溶液定容至10 mL；4℃摇床振荡浸提24 h，8 000 r/min离心10 min，取上清液15 mL，加入硫酸铵晶体至40%饱和度，置4℃冰箱过夜；将过夜后的抽提液8 000 r/min离心20 min，再次收集上清；上清液内再次加入硫酸铵晶体至70%饱和度和100%饱和度，置4℃冰箱过夜，8 000 r/min离心20 min，收集沉淀；将沉淀溶解于10 mL生理盐水，4℃透析48 h，分装后-20℃冻存备用。

1.3.2 微核检测昆明小鼠40只，随机分5组，每组8只，雌雄各半。Ⅰ组为阴性对照组，腹腔注射生理盐水，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别腹腔注射不同品种的菜豆植物凝集素（Ⅱ组：春秋无架四季豆；Ⅲ组：九粒白架豆王；Ⅳ组：Bean Saint esprit a oeil rouge），Ⅴ组为阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺（CP）20 mg/kg，连续注射6 d后间隔24 h取材。

引颈法处死小鼠，取股骨骨髓细胞涂片，置于超净工作台自然干燥后置于甲醇中固定8～10 min；将固定好的涂片放入Giemsa液中染色20～30 min，立即用pH=6.8的磷酸缓冲液冲洗，置于超净工作台中风干。每张涂片计数3 000个嗜多染红细胞（PCE），采用双盲法阅片计数，统计微核发生率。

1.4 统计学分析

采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，应用方差分析进行组间的统计学检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1结果显示，阴性对照组雌鼠与雄鼠骨髓细胞微核发生率分别为（0.499±0.192）‰和（0.833±0.500）‰，为正常微核发生率范围；实验组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ雌鼠与雄鼠骨髓细胞微核发生率都较阴性对照组高，且菜豆植物凝集素含量与微核发生率呈剂量—反应关系，说明菜豆植物凝集素对小鼠骨髓微核发生率具有一定影响；阳性对照组雌鼠与雄鼠骨髓细胞微核发生率分别为（7.999±0.544）‰和（8.333± 0.235）‰，显著高于实验组与阴性对照组。

表13 个品种菜豆植物凝集素对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响Tab.1 Micronucleus ratio of mice bone marrow cells by 3 kinds of kidney bean lectin

从图2可见，阳性对照组雌鼠与雄鼠骨髓细胞微核发生率显著高于阴性对照组（P＜0.05），实验组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ微核发生率较阴性对照组高，但差异无统计学意义。雄性小鼠与雌性小鼠骨髓细胞微核发生率差异无统计学意义，说明性别对微核发生率无影响。

图2 菜豆植物凝集素对小鼠骨髓微核发生率的影响Fig.2Micronucleus ratio of mice bone marrow cells by kidney bean lectin

3 讨论

凝集素是一种非免疫源性的蛋白质或糖蛋白，在植物、动物及微生物中广泛存在。豆科植物的凝集素由2个或4个单体组成，每个单体的分子量为25～30 kD，有一个糖结合位点［7］。糖蛋白在精子和卵细胞的识别和受精过程中发挥重要作用。有研究表明，植物凝集素可以凝集包括人在内的多种动物的精子［8］，并可以抑制小鼠的体外受精（IVF）；对胚胎发育也有一定的影响，不同的植物凝集素致突作用不同，其低剂量促进胚胎发育，高剂量抑制胚胎发育；有效终止早、中、晚期的妊娠［9］。此外，还有研究表明部分植物的甘露糖结合凝集素可以抑制HIV的复制［10］，有望成为阻止艾滋病的流行和进入快速传播期的制剂。然而，植物中的凝集素种类繁多，豆科植物的凝集素就有600多种，如何从中筛选出具有医用价值的凝集素种类是目前面临的问题。

在前期的研究中，笔者已收集了56个品种的菜豆，对其植物凝集素、皂甙、胰蛋白酶抑制剂以及植酸等抗营养因子进行了含量分析，并通过细胞实验和动物实验对其毒性进行的初步探索。本研究挑选植物凝集素含量分别为高、中、低3个级别，分析了其对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响，结果显示菜豆植物凝集素与小鼠微核发生率呈剂量—反应关系，但与阴性对照组微核发生率差异无统计学意义，说明菜豆植物凝集素对实验动物无致突变作用，是相对安全的生物制剂的原料。

（References）

［1］张晓艳，王坤，王述民.普通菜豆种质资源遗传多样性研究进展［J］.植物遗传资源学报，2007，8（3）：359-365.

［2］王昌梅，张丽芬，管荣花.不同方式给予植物凝集素对昆明白小鼠淋巴细胞转化率的影响［J］.现代预防医学，2012，39（1）：107-109.

［3］朱轩轩，周良雪，郭丽军，等.芸豆植物凝集素对细胞生长和增殖的影响［J］.生物技术，2013，23（1）：79-82.

［4］GALATI G，O′BRIEN P J.Potential toxicity of flavonoids and other dietary phenolics：significance for their chemopreven⁃tive and anticancer properties［J］.Free Rad Bio Med，2010，37（3）：287-303.

［5］曹佳.微核试验在中国的应用、发展与展望［J］.遗传，2003，25（1）：73-76.

［6］王昌梅.芸豆植物凝集素对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响［J］.毒理学杂志，2010，24（3）：211-214.

［7］殷晓丽，李婷婷，刘东亮，等.豆科凝集素研究进展［J］.中国生物工程杂志，2011，31（7）：133-139.

［8］王昌梅，张丽芬，杨明洁，等.白芸豆植物凝集素对不同物种精子的凝集与避孕研究［J］.中国计划生育学杂志，2010（5）：14-18.

［9］张丽芬.芸豆植物凝集素（PHA）对小鼠体外受精及胚胎发育的影响［D］.昆明：云南师范大学，2010.

［10］BALZARINI J.Inhibition of HIV entry by carbohydrate binding proteins［J］.Antiviral Res，2006，71（2/3）：237-247.

（责任编辑：陈旷）

Analysis on Micronucleus Formation Induced by Kidney Bean Lectin

MOU Longmei，LIU Yizi，LI Jianan*
（Department of Biotechnology，School of Life Science，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

ObjectiveTo research the effect on micronucleus formation induced by lectin from vari⁃eties of kidney beans.MethodsGiving the mice lectin of three kind of kidney beans by intraperito⁃neal injection for 6 days.Bone marrow cells were collected and microscope slides were prepared by Giemsa staining.Micronucleus ratio was analysed under a light microscope,then judged the mutagenic effect of different kidney bean lection.ResultsThere was no significant difference between experi⁃ment group and negative control group，but positive group was obviously higher than experiment group and negative control group（P＜0.05）.Micronucleus ratio had a dose-effect relationship，but it was independent with gender.ConclusionThe three levels of lectin of three kind of kidney beans have no effect on micronucleus formation of bone marrow cells in mice，they can be used for development of biological preparations.

kidney bean；lectin；micronucleus test；mutagenic effect

R965.3

A

1673-0143（2014）06-0078-04

2014-08-13

牟龙妹（1994—），女，研究方向：生物技术。

*通讯作者：李佳楠（1978—），女，副教授，博士，研究方向：分子生物学。E-mail：lydian_l@163.com