吡诺克辛钠液对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用

王新 李宝华 张明昌 张向东

已知白内障是由于人眼接受外源性紫外线照射和内源性体内产生的氧自由基等导致的晶状体上皮细胞DNA的损伤超越修复能力，以致细胞凋亡所引起的[1]。尤其是老年人晶状体上皮细胞DNA的损伤常年积累导致晶状体上皮细胞凋亡的几率更高；因此，白内障为老年人最常见的眼病，全球致盲人数可达1800万之多[2]。本研究探讨吡诺克辛钠液对H2O2诱导的晶状体上皮SRA01/04细胞凋亡的抑制作用。分析应用氧化应激抑制药对白内障的预防作用。

1 材料与方法

1.1培养的细胞来源细胞SRA01/04购自中国医学科学院肿瘤医院生物检测中心细胞库。SRA01/04细胞用含体积分数为10%FBS(TBD公司，天津)的低糖DMEM(Sigma公司，美国)培养基常规培养；培养条件为37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度。细胞记数后稀释成30×106L-1的细胞悬液，用吸管吸出单细胞悬液接种于新的培养瓶里。当细胞铺满瓶底达80%以上处于对数生长期时，进行传代培养，当细胞达到一定数量时即可进行实验。

1.2主要试剂及仪器吡诺克辛钠液(武汉五景药业有限公司)、低糖DMEM培养基(Sigma公司，美国)、Bcl-2鼠单抗(SantaCruz公司，美国)、Bax鼠单抗(SantaCruz公司，美国)、Caspase-3的兔多抗(Zymed，美国)；图像分析仪(上海山富科技仪器厂)。

1.3实验分组将培养的人晶状体上皮细胞SRA01/04使用一次性六孔无菌培养皿培养(30×106L-1的细胞悬液，每孔2 mL)。随机分为3组，每组2个复孔，分别为：先加药组，即先在细胞培养液内加入吡诺克辛钠液300 μL培养23.5 h后，再加0.5 μmol·L-1H2O2培养30 min；后加药组，即在细胞培养液内先加入0.5 μmol·L-1H2O2，30 min后再加吡诺克辛钠液300 μL培养23.5 h；对照组，即不加H2O2及药物培养24 h。

1.4应激反应检测羟自由基水平检测：应用试剂盒(建成生物工程研究所，南京)严格按照其说明书检测各组细胞的羟自由基水平。

一氧化氮合酶(NOS)活性检测：各组完整细胞的滴片标本以40 g·L-1多聚甲醛固定10 min后，PBS洗3遍，加底物37 ℃放置1 h，水洗终止反应，油镜下观察照相。同时进行以PBS代替底物的阴性对照。

1.5免疫组织化学反应检测(1)将细胞滴片标本从-20 ℃冰箱取出，用冷风吹3 h，使其彻底干燥。将玻片放入3 g·L-1Triton X-100/PBS溶液中，室温放置10～20 min。(2)取出玻片，各组细胞的滴片标本以40 g·L-1多聚甲醛固定10 min后，室温下PBS溶液漂洗3次，每次5 min。(3)将玻片用吸水纸吸干后，用体积分数10%正常山羊血清封闭液封闭20～30 min。(4)用吸纸吸除多余血清，分别加入1100稀释的一抗工作液：Bcl-2鼠单抗及Bax鼠单抗，Caspase-3的兔多抗。置封闭湿盒内4 ℃孵育过夜。次日，将湿盒从4 ℃冰箱中取出，室温放置20 min。然后室温下免疫组织化学用PBS溶液漂洗3次，每次5 min。(5)加入1200稀释的HRP/ALP标记羊抗鼠或抗兔二抗，室温放置30 min。然后室温下免疫组织化学用PBS溶液漂洗3次，每次5 min。(6)应用ABC试剂盒和DAB底物(中杉)显色，37 ℃显色20 min，显色后立即用蒸馏水将DAB和H2O2洗去。(7)油镜下观察照相，同时设不加一抗(用PBS溶液代替)的空白对照。

1.6凋亡情况检测各组细胞的滴片标本用40 g·L-1多聚甲醛固定10 min后，PBS洗3遍，首先用5 ng·mL-1蛋白酶K 37 ℃消化5 min，PBS洗3遍，用40 g·L-1多聚甲醛复固定，对每个标本加15 μL TdT 缓冲液，内含0.5 μL的TdT酶和0.5 μL Bio-dUTP，4 ℃过夜。次晨以1300稀释的链酶亲和素-碱性磷酸酶37 ℃放置20 min，用pH 7.5 Tris-HCl缓冲液洗3次，再用pH 9.5 Tris-Cl 缓冲液洗2次，NBT/BCIP显色，镜下观察显色情况，水洗终止反应，照相。同时做不加TdT酶的阴性对照。计数各组200个细胞，计算细胞中凋亡细胞的百分率。

2 结果

2.1应激反应NOS染色呈粉紫色细颗粒(图1)，加药组细胞，尤其后加药组细胞由于凋亡的缘故，细胞体积多小于对照组。NOS分布于胞质；先加药组NOS染色呈淡紫色细颗粒状；后加药组NOS染色呈紫色细颗粒者较多；对照组NOS染色呈阴性。各组NOS活性值和羟自由基检测水平见表1。由表1知，后加药组的NOS活性及羟自由基检测值高于先加药组，更高于对照组，两组检测指标之间呈正相关(r=0.88，P<0.01)。

2.2Bcl-2、Bax及Caspase-3表达情况Bcl-2、Bax表达于胞质，染色呈棕黄色细颗粒状(图2)，Bcl-2-IR(免疫反应性) 分布于胞质，先加药组染色呈淡棕色细颗粒状，比对照组减弱；后加药组Bcl-2-IR的着色更弱；对照组Bcl-2-IR染色呈较明显棕色细颗粒。Bax-IR分布于胞质：先加药组Bax-IR呈棕色细颗粒状，比对照组着色深；后加药组比对照组着色显著增强；对照组Bax-IR染色呈淡棕色细颗粒状。Caspase-3-IR主要分布于胞核：先加药组Caspase-3-IR染色呈深棕色细颗粒状，比对照组着色较深；后加药组Caspase-3-IR呈深棕色细颗粒状，比对照组着色深；对照组呈棕色细颗粒状(图2)。其各自表达的灰度值见表2。

表1 各组细胞NOS活性值及羟自由基检测水平的比较

表2 各组细胞Bax、Bcl-2及Caspase-3表达的灰度值比较

Figure 1 Activity of NOS showed pinkish purple fine particles in the cytoplasm.The post-drug group showed more pinkish fine particle,and the cell capacity was smaller than the control group.The control group had no NOS activity.It was negative.Pre:Pre-drug group;Post:Post-drug group;Control:Control group(×1000) NOS染色呈粉紫色细颗粒状分布于胞质，后加药组紫色细颗粒较多，细胞体积多小于对照组，对照组未见NOS活性，呈阴性。Pre代表先加药组，Post代表后加药组，Control代表对照组

2.3凋亡情况检测TUNEL法检测凋亡的信号呈蓝紫色细颗粒状，分布于胞核，可呈半月状移位于细胞边缘，有时可见凋亡小体，凋亡的细胞体积缩小(图3)。先加药组TUNEL染色呈紫色细颗粒状，主要分布于胞核；后加药组亦主要分布于胞核，且胞核多偏于细胞一侧，有时可附有凋亡小体；对照组图中未见TUNEL阳性信号。

对照组的凋亡率为5%，先加药组为25%；后加药组为50%，3组之间差异有统计学意义(χ2=103.98，P<0.01)。

3 讨论

产生和降解氧化产物之间失衡会引起氧化应激，这个名词有近20 a的历史并且在医学文献中经常出现[3]。从生物氧化反应的分子过程看，氧作为一种必需物质具有益害两重性。一方面，氧作为呼吸链的终端电子受体参与产生的氧化磷酸化反应，是维持生命的重要能量代谢过程；另一方面，氧可通过一系列化学反应生成有害的超氧歧化物和各种不同的反应氧中介物(自由基、反应氧簇)，造成细胞损伤并导致疾病和衰老。近年研究发现晶状体上皮细胞凋亡是白内障发生的重要原因，它发生于混浊之前，自由基是晶状体上皮细胞凋亡的重要激发因素。

细胞凋亡即程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)早在20世纪70年代初已被提出。细胞凋亡是多细胞生物生命活动中，在生理或外界因素刺激下进行的自身调节机制。bcl-2是公认的长寿基因，最初从人的滤泡性B细胞淋巴瘤中分离出来，通过转基因动物和基因转染发现。bcl-2基因对许多原因引起的细胞凋亡具有明显的抑制作用。bcl-2基因编码的蛋白是跨膜蛋白，位于线粒体膜、核膜及胞浆内质网膜上。bcl-2能抑制多种模型中的细胞凋亡。细胞凋亡是由于细胞中活性氧类物质积累引起的，一些抗氧化剂能阻断生长因子缺失引起的凋亡，而bcl-2能抑制过氧化物诱导的凋亡。bcl-2家族还包括bcl-x、bax及bad，其中bcl-2和bcl-x抑制细胞凋亡，而bax及bad则促进细胞凋亡[4]。

Figure 2 Signal of Bcl-2,Bax in each group were located in cytoplasm.In Bcl-2-IR there were lest pinkish fine particle in post-drug group.The control group had more pinkish fine particle.And in Bax-IR we could get the adverse results.The signal of caspase-3 in each group was located in nuclei.It was just like the result in Bax-IR.Comparing about the immunostaining In each group.We can compare the value of each group through the detection index.Pre:Pre-drug group;Post:Post-drug group;Control:Control group (×1000) Bcl-2、Bax表达于胞质呈棕黄色细颗粒着染：Bcl-2-IR先加药组呈淡棕色细颗粒状，比对照组着色弱，后加药组Bcl-2-IR的着色更弱，对照组Bcl-2-IR的棕色细颗粒较明显；Bax-IR则刚好相反。Caspase-3-IR主要表达于胞核，先加药组Caspase-3-IR呈深棕色细颗粒状，着色深；后加药组Caspase-3-IR亦呈深棕色细颗粒着染。Pre代表先加药组，Post代表后加药组，Control代表对照组(×1000)

Figure 3 Apoptotic signal of TUNEL in each group were dyed to amethyst and all located in nuclei.There were the amethyst particles in the nuclei in the pre-drug group,and there were the amethyst particle in the side of the nuclei,sometimes the apoptotic body could be seen in the post-drug group.No positive signal in the control group.Pre:Pre-drug group;Post:Post-drug group;Control:Control group(×1000) TUNEL检测凋亡的染色呈紫色细颗粒状，主要分布于胞核。先加药组TUNEL染色呈紫色细颗粒状，主要分布于胞核；后加药组TUNEL染色呈紫色细颗粒状，主要分布于胞核，有时可附有凋亡小体；对照组图中未见TUNEL阳性染色。Pre代表先加药组，Post代表后加药组，Control代表对照组(×1000)

在对哺乳动物细胞凋亡进行研究时，发现一组ICE类蛋白。它们均具有在天冬氨酸残基后切断肽键的能力，转染不同细胞后可诱导凋亡，统称为Caspase家族[3]。迄今为止已鉴定了14种此类蛋白酶，按其被发现的先后顺序分别称为Caspase 1～14。Caspase被誉为“杀手”蛋白酶或“凋亡步兵”，是细胞凋亡的重要标志，也是凋亡的最终共同通路。Caspase-3 mRNA水平在晶状体上皮细胞凋亡过程中无明显改变。这说明在凋亡信号作用下Caspase主要通过增强酶活性介导晶状体上皮细胞凋亡，而非依赖增加自身的合成。细胞凋亡是一种很复杂的生理及病理现象，细胞凋亡的线粒体途径与死亡受体途径是相互作用的。早期研究发现两者可在Caspase-3处会合，并通过Caspase-3激活下游底物而诱导细胞凋亡。两条途径在bcl-2基因产物处也发生会合[5]。

0.5 mmol·L-1H2O2是体外氧化实验中常用的浓度[6]，有关H2O2对体外培养的晶状体上皮细胞及其抑制药物的作用是氧化反应研究领域的热点之一。Wang等[7]报道水杨酸钠抑制H2O2诱导培养的人晶状体上皮HLB-3细胞凋亡，与其上调热休克蛋白27有关。Chen等[8]报道牛磺酸抑制H2O2诱导培养的牛晶状体上皮细胞凋亡，可延缓或减轻白内障的发病和进程。Huang等[9]报道Co-SZ滴眼液抑制H2O2诱导培养的晶状体上皮细胞凋亡的机制与上调Bcl-2 表达和下调Bax 表达有关。Peterson等[10]报道晶状体上皮细胞凋亡与Caspase-3激活有关。在H2O2引起的人晶状体上皮细胞的氧化应激下细胞的糖分解、线粒体活性被破坏[11]，甚至可导致DNA损伤，细胞凋亡。

本实验应用的含有牛磺酸的吡诺克辛钠液为醛糖还原酶抑制物，具有抑制H2O2诱导的氧化应激反应；加此抑制药后与凋亡相关的Bax与Bcl-2的表达和Caspase-3表达水平减低，细胞凋亡率也降低。Burch等[12]指出氧化应激反应包括两类：反应氧簇和反应氮簇，因此本实验以羟自由基水平和NOS酶活性各检测氧化应激反应的反应氧簇和反应氮簇；结果显示预先加药组的反应氧簇和反应氮簇均低于后加药组，其抑制效应更强于后加药组。此研究结果提示在晶状体出现混浊之前应用抑制药物的预防效应可能更优于晶状体出现混浊之后，更具有延缓白内障发病的作用。

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