重组人干扰素α2b注射液稳定性研究

倪晓燕，王荣海，宋礼华，储成风，李增礼，周乐春

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230031；2.安徽安科生物工程（集团）股份有限公司，安徽 合肥 230088；3.安徽省生物研究所，安徽 合肥 230088）

重组人干扰素α2b注射液稳定性研究

倪晓燕1，2，王荣海2，3，宋礼华2，3，储成风2，李增礼2，周乐春2

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230031；2.安徽安科生物工程（集团）股份有限公司，安徽 合肥 230088；3.安徽省生物研究所，安徽 合肥 230088）

目的 考察重组人干扰素α2b注射液的稳定性。方法 按照《中国药典》2010年三部的方法进行检测，其中干扰素蛋白纯度采用高效液相法测定，光照试验、振摇试验、冻融试验、加速试验、低温长期留样观察方法均采用药典方法。结果 除了冻融试验中反复冻融8次后和加速试验中（37±2）℃放置3个月，干扰素 α2b效价下降至理论值的80%以下，其余试验抽样点均符合质量标准的规定。结论 该品在避光，2～8℃密闭的储存条件下性质稳定，贮存期可为2年左右。

重组人干扰素 α2b注射液；稳定性；无血清处方

重组人干扰素被广泛的应用于治疗毛细管白血病、喉多发性乳头瘤病、艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）相关的卡波西肉瘤、急慢性病毒性肝炎、病毒性角膜炎［1-2］疾病，通常被制成冻干制剂或液体制剂。为保护干扰素活性，通常在制剂配方中加入人血白蛋白（Human Sero Albumin，HSA）或白蛋白替代品羟乙基淀粉、葡聚糖、聚山梨酯80、聚乙二醇等。HSA价格昂贵，并且会带来感染血液病毒的风险。聚山梨酯80属于亲水型非离子表面活性剂，常用作助溶剂、乳化剂和稳定剂等。有研究发现聚山梨酯80可能会造成囊状细胞的退化，从而引起外周神经毒性［3］。聚山梨酯 80本身具有不稳定性［4］，还能导致溶血发生，应慎用含吐温80的静脉注射剂［5-6］。因此，本课题旨在寻找一种既不含有 HSA也不含有吐温80，并且能保持干扰素生物活性的液体制剂配方。在参考国内外文献资料的基础上，通过研究确定了以组氨酸、EDTA二钠、氯化钠、磷酸盐缓冲液等组成重组人干扰素 α2b注射液的处方，以下是对此处方稳定性进行的系统研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 净化工作台（SW-CJ-1F型，苏州净化设备有限公司），CO2培养箱（2406-2，Shel Lab），倒置显微镜（XPS-1B，重庆光电仪器有限公司），Waters 1525高效液相色谱仪，Waters 1489紫外-可见检测器，Breeze 2数据采集软件控制（Waters），TSK G2000SWXL色谱柱，实验室 pH计（FE20，Mettler Toledo），万分之一电子天平（ML203，Mettler Toledo），恒温培养箱（BSC-150，上海博讯实业有限公司）。

1.2 试药 重组人干扰素 α2b注射液［安徽安科生物工程（集团）股份有限公司提供，规格：每支600 万IU，批号20110607、20110611、20110615］，异丙醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。WISH细胞株，VSV病毒［安徽安科生物工程（集团）股份有限公司提供］。IFN-α标准品购于中国药品生物制品检定所（批号：07-01）。

2 方法

2.1 试验方法

2.1.1 光照试验 将重组人干扰素 α2b注射液置于装有日光灯的冰箱里，照度条件为（4 500±500）Lx，温度2～8℃，与第5天和第10天取样，按考察项目检测。

2.1.2 振摇试验 避光，室温下，将重组人干扰素α2b注射液置于摇床（250 r·min-1）中振摇，第4天、第8天取样按考察项目检测。

2.1.3 冻融试验 重组人干扰素α2b注射液反复冻融0、2、4、6、8次后，按考察项目检测。反复冻融试验的具体操作方法是：将供试品置于 -20℃冰箱中12 h使供试品溶液完全冻结，然后取出置于 2～8℃冰箱中8 h使供试品溶液完全融化成液体状态，如此反复多次，分别取样检测。

2.1.4 加速试验 将重组人干扰素 α2b注射液置于（25±2）℃条件下，于0、1、2、3、6月分别取样；将重组人干扰素 α2b注射液置于（37±2）℃条件下，于0、1、2、3月分别取样，上述样品按考察项目检测。2.1.5 低温长期试验 将重组人干扰素 α2b注射液置于（6±2）℃条件下，于0、3、6、9、12、18、24月分别取样，按考察项目检测。

2.2 检测项目 外观性状、干扰素效价（生物学活性）、pH值、蛋白纯度、无菌检查。长期试验最后一个时间点增加异常毒性检测。

2.3 检测方法 蛋白纯度采用高效液相色谱法检测。色谱条件为：色谱柱TSK G2000SWXL；流动相为20 mmol·L-1磷酸盐—145 mmol·L-1氯化钠—5%异丙醇缓冲液，pH 7.0；上样量200 μL；在波长280 nm处检测，按面积归一化法计算。其余检测项均按照 2010《中国药典》三部［7］的规定检查。

3 结果

3.1 光照试验 重组人干扰素α2b注射液强光照射第5天和第10天取样按考察项目检测，结果表明强光照射后，干扰素效价没有降低，在合格范围内，结果见图1。注射液外观性状、pH值、蛋白纯度均无明显变化，无菌试验合格，结果见表1。

3.2 振摇试验 重组人干扰素α2b注射液在室温下振摇第4天、第8天后取样检测，结果表明干扰素效价没有降低，在合格范围内，结果见图 2；其它项均无明显变化，结果见表2。

图1 光照试验干扰素效价结果

表1 重组人干扰素α2b注射液在强光下的稳定性结果

图2 振摇试验干扰素效价结果

表2 重组人干扰素α2b注射液在振摇下的稳定性结果

3.3 冻融试验 重组人干扰素 α2b注射液反复冻融2、4、6、8次后分别取样检测，结果表明反复冻融6次，干扰素效价虽有降低但仍在合格范围内，但反复冻融8次后，干扰素效价大幅度降低，且已低于0时效价的80%，结果见图3；样品其余检测项均无明显变化，结果见表3。

3.4 加速试验 重组人干扰素 α2b注射液分别在（25±2）℃条件下储存6个月和在（37±2）℃条件下储存2个月，干扰素效价均在合格范围内，但在（37±2）℃条件下储存 3个月干扰素效价降低至 0时效价的80%以下，结果见图4-1、4-2；样品其余检测项均无明显变化，结果见表4-1、4-2。

图3 冻融试验干扰素效价结果

表3 重组人干扰素α2b注射液在反复冻融下的稳定性结果

图4-1 加速试验干扰素效价结果（25±2℃）

图4-2 加速试验干扰素效价结果（37±2℃）

3.5 低温长期试验 取3批重组人干扰素α2b注

表4-1 重组人干扰素 α2b注射液加速试验结果（25±2℃）

表4-2 重组人干扰素 α2b注射液加速试验结果（37±2℃）

射液置于（6±2）℃条件下，于 0、3、6、9、12、18、24月取样检测的结果见表 5。结果表明，本品在低温环境下留样 24个月，干扰素效价在合格范围内保持稳定，结果见图5；本品 24月异常毒性试验结果合格；其余各项指标与 0时相比无明显变化，均符合质量标准，结果见表5。

图5 低温长期试验干扰素效价结果

4 讨论

重组人干扰素 α2b冻干制剂虽具有保存期长、生物活性稳定等优点，但其冷冻干燥的过程非常复杂，药物的结构可能受其中的物理化学变化影响而发生变化，特别是蛋白质多肽类药物的二、三级结构易受破坏［8-10］。并且冻干制剂病人使用之前还需要复溶，依从性差。因此从经济和使用便捷性方面考虑，市场更青睐可长期稳定保存干扰素液体制剂。

表5 重组人干扰素 α2b注射液低温长期试验结果（6±2℃）

本课题通过研究确定了由组氨酸、EDTA二钠、氯化钠、磷酸盐缓冲液等组分构成的重组人干扰素α2b注射液，不含HSA和聚山梨酯80。L-组氨酸是一种半必需氨基酸，氨基酸是一种常见的蛋白质保护剂［11］，有文献报道其用于重组人红细胞生成素中［12］。EDTA二钠作为络和剂、洗涤剂、血液抗凝剂及金属掩蔽剂广泛应用于分析化学领域，每天摄入量不得超过2.5 mg·kg-1［13］，在干扰素注射液中EDTA二钠的含量可以通过 HPLC法准 确 测 定［14］。

我们筛选出的此种不含 HSA、吐温 80的重组人干扰素α2b注射液，在强光照射、室温振摇、反复冻融、加速试验中，均保持较好的稳定性。在 6±2℃储存条件下，干扰素活性能保持2年基本不变。通过系统稳定性研究结果，我们可知由组氨酸、EDTA二钠、氯化钠、磷酸盐缓冲液组成的制剂配方能较好的保护重组人干扰素 α2b生物活性，其制剂在避光、2～8℃密闭储存 2年质量符合《中国药典》2010版规定。

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Study on Stability of Recombinant Human Interferon α2b Injection

NI Xiao-yan1，2，WANG Rong-hai2，3，SONG Li-hua2，3，et al
（1.Anhui University of Chinese Medicine，Hefei，Anhui 230031，China；2.Anhui Anke Biotechnology （Group）Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230088，China，3.Anhui Biological Institute，Hefei，Anhui 230088，China）

Objective To study the stability of recombinant human interferon α2b injection.Methods According to the methods of Ch.P for testing，the protein purity of interferon were determined by HPLC.The stability of the samples were tested by strong-light，shaking，freeze thaw，accelerating experiment and prolonged low-temperature storage.Results After being exposured to repeated freezing and thawing 8 times and accelerating test for 3 months in 37℃，interferon potency was reduced to less than 80%of the theoretical value，but on other experiments，it was rather stable.Conclusion This injection should be kept away from high light and may be stored for 2 years at 2～8℃.

recombinant human interferon α2b injection；stability；serum free formula

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.008

2013-11-21，

2014-02-08）

国家“重大新药创制”科技重大专项（No 2011ZX09202-301-02）

倪晓燕，女，硕士研究生

宋礼华，男，研究员，博士生导师，研究方向：生物技术领域的研究、产业化开发，E-mail：songlh＠ankebio.com