PPARγ C161T基因多态性表达与进展性脑梗死相关性研究

沈 双 卢振产 胡正刚 王亚仙 浙江省湖州市中心医院神经内科 湖州 313000

PPARγ C161T基因多态性表达与进展性脑梗死相关性研究

沈 双 卢振产 胡正刚 王亚仙 浙江省湖州市中心医院神经内科 湖州 313000

目的探讨PPARγ C161T基因多态性及其表达与进展性脑梗死的关系。方法进展性脑梗死患者225例纳入进展组，同期住院的非进展性脑梗死患者225例为非进展组。应用多聚酶链-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测两组PPARγ基因C161T的基因型，酶联免疫吸附（ELISA）法检测PPARγ基因表达水平。结果进展组和非进展组患者PPARγ C161T基因多态性频率无明显差异（P＞0.05）。入院时、入院后72h以及发病后4周，携带C等位基因脑梗死患者的PPARγ表达量均低于携带T基因的脑梗死患者（P＜0.01），并且在携带C等位基因患者中进展组PPARγ表达量低于非进展组（P＜0.01）。与入院时比较，入院后72h以及发病后4周各基因型的PPARγ表达量明显升高（P＜0.01）。结论PPARγC161T基因多态性的表达可能与进展性脑梗死的发生有关。

PPARγ基因；进展性脑梗死；单核苷酸多态性

进展性脑梗死（progressive ischemic stroke，PIS）是缺血性脑卒中的一种,约占所有缺血性脑卒中的20%～40%，属于难治性脑血管疾病，研究显示进展性脑梗死的致残率以及病死率较非进展性脑梗死增加近4倍[1-2]。研究表明，动脉粥样硬化、血管炎症及其相关的不稳定斑块与进展性脑梗死密切相关[3]。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome Proli-feratoractivated receptors gamma，PPARγ）在动脉粥样硬化、炎症、血管重构方面起着重要的调节作用[4]。PPARγ可能通过对血管动脉粥样硬化以及炎症等的调节，从而影响进展性脑梗死的发生[5]。本研究旨在探讨PPARγ C161T基因多态性及其PPARγ表达与进展性脑梗死之间的相关性。

1 临床资料

1.1一般资料 选择2010年1月—2013年9月本院神经内科住院的脑梗死患者450例，其中进展性脑梗死患者225例，男133例，女92例，年龄41～80岁，平均（65.36±12.25）岁；非进展性脑梗死225例，男133例，女92例，年龄20～80岁，平均（66.42± 12.76）岁。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2诊断标准 脑梗死诊断标准参照1995年第四届全国脑血管病学术会议修订的脑梗死诊断标准[16]；进展性脑梗死诊断标准：根据改良TOAST分型，把临床动脉粥样硬化血栓型（atllerothrombosis，AT）以及小动脉病变（small artery disease，SAD）这2类脑梗死患者纳入进展性脑梗死诊断标准[2，6-7]，且入院后（或起病6h后）1周内至少每24h进行美国国立卫生院卒中量表（NIHSS）评分1次，并与入院后第1次NIHSS评分比较，任何一次NIHSS评分较首次评分增加≥2分，判定为进展性脑梗死（NIHSS评分均为两位医师独立评分后的平均分，以排除不同医师评分的误差）

1.3纳入标准 ①年龄20～80周岁，急性起病；②发病后48h内入院；③符合脑梗死诊断标准，并经头颅CT或MR证实；④符合进展性脑梗死诊断标准。

1.4排除标准 ①溶栓患者、改良TOAST分型的其他类型患者：心源性栓塞（cardioembolism，CE）患者：（高度怀疑心源性栓子来源：心房颤动病史、心电图提示心房颤动、超声心动图检查见附壁血栓及瓣膜赘生物），其他原因的中风（stroke of other setermined etiology，SOD）如高凝状态、血液系统疾病、动脉夹层、烟雾病、动脉炎、红斑狼疮等，不明原因的中风（stroke of undetermined etiology，SUD）；②抗血小板治疗禁忌证的患者；③合并糖尿病患者正在服用噻唑烷二酮类糖尿病药物（如吡咯列酮），严重心、肺、肝、肾疾病患者；④存在严重自身免疫性疾病、恶性肿瘤者；⑤患者及家属不能配合。

2 方 法

2.1PPARγ C161T基因多态性检测 选择rs3856806为单核苷酸多态性（SNP）位点,采用限制性酶切片段多态性的方法（PCR-RFLP）检测SNPs的基因型。①DNA提取试剂盒提取基因组DNA。②PCR反应：上游引物：5’-CAAGACAACCTGCTACAAGC-3’，下游引物：5’-TCCTTGTAGATCTCCTGCAG-3’。PCR反应条件：94℃预变性 5min，94℃变性 45s，55℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环，最后 72℃延伸10min，基因的扩增长度为200bp，经2%琼脂糖凝胶电泳30min，在凝胶成像系统下观察PCR结果。③酶切体系：PCR产物长度为200bp，经限制性内切酶（EcoR72I酶）于恒温37℃水浴8h后酶切，经2%琼脂糖凝胶电泳30min，在凝胶成像系统下观察结果，PCR产物经过酶切后可出现三种情况：CC纯合子型被酶切为120bp和80bp两个条带，TT纯合子型不能被酶切仍为200bp一个条带，CT杂合子型部分被酶最后表现为200bp、120bp和80bp三个条带。DNA提取试剂盒、PCR Tap DNA聚合酶、限制性内切酶、DNTPMix脱氧核苷酸混合物（Promega公司）；PCR引物由宝生物工程（大连Takara公司合成）；淋巴细胞分离液（Ficoll400，上海生物制品所）；TRIzol试剂盒（Gibco公司），Hankc’s液（Sigma公司）；PPARγ试剂盒（Genzyme公司）。

2.2PPARγ表达水平检测 ①人外周血单核细胞分离：患者于入院时、入院72h及发病4周分别抽取肘部静脉血约10mL，30min内分离出白细胞悬液，Hankc’s液稀释，再用淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法分离周围血单核细胞。②RNA提取：将细胞粉碎后采用ELISA法测定细胞悬液PPARγ水平，操作严格按照PPARγ试剂盒说明书进行。

2.3统计学方法 应用SPSS11.5软件包。计量资料以（） 表示，采用t检验或方差分析，计数资料采用卡方检验或方差分析，若不符合正态分布的计量资料，采用对数转换符合正态分布后再进行相关检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1两组PPARγC161T基因的基因型和等位基因分布 对本次研究选择的样本进行卡方检验后符合Hardy-Weinberg平衡，说明本次研究样本是来自随机的群体，可以进行等位基因关联分析。进展组各型等位基因频率与非进展组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组PPARγ基因型及等位基因分布比较 例（%）

3.2两组PPARγ表达水平比较 入院时、入院后72h以及发病后4周，携带C等位基因患者中进展组PPARγ表达量均低于非进展组（P＜0.01）；但是进展组T型基因携带者的PPARγ表达始终与非进展组表达量相当（P＞0.50）。携带C等位基因脑梗死患者的PPARγ表达量低于携带T基因的脑梗死患者（P＜0.01）。与入院时比较，入院后72h、发病后4周，进展组与非进展组两种基因型携带者PPARγ的表达均明显升高（P＜0.01）。见表2。

表2 两组不同基因型不同发病时间PPARγ表达水平比较（） ng/L

表2 两组不同基因型不同发病时间PPARγ表达水平比较（） ng/L

注：与C基因型比较，*P＜0.01；与入院时比较，△P＜0.01

组别进展组非进展组n/例225 225入院时 入院后72h 发病后4周tP CC 168.32±74.35 221.91±77.35 7.49＜0.01 TT+CT 223.61±59.46* 219.37±65.83* 0.68＞0.50 CC 252.38±62.38△372.12±69.35△19.40＜0.01 TT+CT 351.84±59.46*△348.56±61.22*△0.53＞0.50 CC 507.64±72.16△606.51±68.31△14.99＜0.01 TT+CT 575.91±71.33*△581.55±72.29*△0.89＞0.50

4 讨论

PPARγ作为过氧化物酶体增殖体激活受体家族的一员，PPARγ在脂肪、脾、肾上腺、肝、肠道、胃、胰腺、骨骼肌、巨噬细胞中均有不同程度的表达，PPARγ全程参与了动脉粥样硬化以及影响机体局部和整体炎症，既往的研究已经证实在动脉粥样斑块中发现过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）高表达，而且在体内粥样硬化的炎性细胞-巨噬细胞上发现高度表达的PPARγ，显示PPARs所介导的炎症与动脉粥样硬化的发展有着密切联系，更是直接提示PPARγ参与了粥样斑块的形成与发展[8]。C161T为位于PPARγ基因6号外显子的一个重要突变，此位点野生型CC纯合子占多数,部分人群此基因位点突变为CT杂合子甚至突变为TT纯合子。既往的研究已经表明携带有野生型CC纯合子的人群较携带有突变T基因的人群更易发生颈动脉粥样硬化及颈动脉狭窄[9]，接下来的研究又进一步证实携带有野生型CC纯合子的人群不管其是否合并有糖尿病会比突变携带有突变T基因的人群更易发生血脂紊乱及罹患冠状动脉粥样硬化性疾病[10-12]。本研究结果不能显示C等位基因增加脑梗死人群进一步发生进展性脑梗死的风险，可能由于纳入样板量偏少的缘故尚不能发现在脑梗死患者中携带有野生型CC纯合子基因型与脑梗死进展性之间具有相关性。

既往的研究已经表明，PPARγ不仅能够干预动脉粥样硬化的过程，还对神经细胞有直接保护作用。Shimazu等[13]研究表明，PPARγ的激活可增加铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn2SOD），清除自由基。PPARγ的激活可以保护脑缺血再灌注中神经元损伤。另外，脑缺血后炎症反应的损伤作用已受到人们的关注。树突状细胞是一种重要的抗原提呈细胞,通过释放细胞因子参与脑缺血后的炎症损伤，PPARγ激动剂环格列酮可减轻OX2LDL诱导的树突状细胞的表达,抑制树突状细胞的入胞作用,减少树突状细胞所引发的免疫反应，减少脑缺血后的炎症反应[14]。Chang等[15]研究表明吡格列酮不依赖于低密度脂蛋白胆固醇的降低就逆转斑块的进展。本研究结果显示，在进展性及非进展性脑梗死人群中携带有T等位基因患者的PPARγ表达水平明显高于携带有C等位基因患者（P＜0.01）。这从某种程度上说明了C161T基因多态性下的PPARγ的表达与脑梗死后发生进展有一定的相关性，但是由于本实验为一队列设计研究，不能确定不同基因型的PPARγ的表达与进展性脑梗死之间有无明确的因果关系，有待于进一步的研究。

本课题研究发现，发病4周后经积极的临床治疗进展组和非进展组C161T各基因型的PPARγ表达量明显高于入院时水平（P＜0.01），高度提示PPARγ在促进神经细胞修复方面可能起到了一定的作用，提示在脑梗死的超急性期或急性期PPARγ的表达可能与神经功能有一定的相关性。是否PPARγ的表达始终能够影响脑梗死的急性期或一直影响至恢复期仍不得而知，需进一步的相关研究。

本研究结果显示，PPARγC161T基因多态性中C等位基因的PPARγ表达水平与进展性脑梗死之间存在相关性。但本研究只是一个小样本的队列研究，尚不能明确PPARγ是否是进展性脑卒中的一个独立影响因素，需要进一步的深入探索。

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Association of C161T Polymorphism on PPARγ Gene with Progressive Ischemic Stroke

S HEN Shuang,LU Zhenchan,HU Zhenggang,WANG Yaxian.Department of Neurology,Huzhou Central Hospital of Zhejiang Province, Huzhou(313000),China

ObjectiveTo investigate the relationship between C161T polymorphism on peroxisome proliferatoractivated receptor gamma（PPARγ）gene and progressive ischemic stroke.MethodsThe C161T variants on PPARγ gene of 225 patients with progressive ischemic stroke and 225 non-progressive ischemic stroke patients matched with age,gender,and past history of disease was examined by using polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）.The serum PPARγ was measured by ELISA.ResultsNo statistical differences in frequencies of genotype and allele was noted between the progressive and non-progressive ischemic stroke patients（P＞0.05）.At admission,72h after admission and 4 weeks after onset,the C allele carriers had lower levels of PPARγ,compared with the T allele carriers（P＜0.01）.In C allele carriers,the PPARγ expression in progressive ischemic stroke patients was significantly lower than that in non-progressive patients（P＜0.01）.Compared with baseline,the PPARγ expression significantly increased in each genotype at 72h after admission and 4 weeks after onset（P＜0.01）.ConclusionThe C161T polymorphism on PPARγ gene may be related to onset of progressive ischemic stroke.

PPARγgene；progressive ischemic stroke；single nucleotide polymorphism

2014-04-18

修回日期：2014-06-06

浙江省湖州市科技计划项目（No.2012YS16）

王亚仙，Tel：13757077279；E-mail：zclutcm@gmail.com