基于慢病毒载体系统构建重组JSRV-NM假病毒

龚淑敏 李光明 吴志敏 董莉真 程 彬 张 斌 朱 泽△

基于慢病毒载体系统构建重组JSRV-NM假病毒

龚淑敏1李光明2吴志敏2董莉真2程 彬2张 斌2朱 泽2△

目的 采用慢病毒质粒结构重组JSRV-NM假病毒，克服JSRV-NM病毒只能通过绵羊支气管穿刺接种扩增，不能通过体外细胞培养扩增的问题。方法采用慢病毒高效包装系统pMD.G、pCMV-HIV△8.2和pHIV-eGFP，以JSRV-NM病毒的env包膜质粒pCMVJSRV-NM替代VSV-G病毒的包膜质粒pMD.G，转染293T细胞，复制、包装并产出重组的JSRV-NM假病毒。用real-time PCR检测WPRE表达来测定假病毒的滴度，用接种24孔板的293T细胞检测假病毒感染力。结果成功重组了基于慢病毒质粒结构的JSRV-NM假病毒，可超速离心浓缩成高滴度（1×108TU/mL）的病毒，Lv-JSRV-NM包膜与Lv-VSV-G包膜按感染复数（MOI）=3的比例感染Hela细胞具有相同的感染能力。结论基于慢病毒质粒构建的JSRV-NM假病毒，能够在293T细胞中复制和扩增，产出的假病毒具有稳定性、感染力和安全性，符合二级生物实验室安全的要求。

JSRV-NM病毒；假病毒；慢病毒载体；env基因；病毒包装

加亚嘉西科逆转录病毒（Jaagsiekte retrovirus，JSRV）属于RNA逆转录病毒，经呼吸道传播，主要引起羊肺腺瘤（sheep pulmonary adenomatosis，SPA）。JSRV最早于1976年由英国爱丁堡大学的Sharp教授发现并分离鉴定，其包膜env基因是原癌基因，具有肺腺癌致瘤性[1-2]，前期有研究分离纯化了我国内蒙古肺腺瘤绵羊中存在的JSRV[3]，并命名为加亚嘉西科逆转录病毒内蒙古病毒株（JSRV-NM）[4]。JSRV-NM基因组RNA为线性+ssRNA，全长7 642 bp，其基因组RNA编码区内具有相互重叠的gag、pro、pol、env基因的典型结构[5]。慢病毒载体系统是以人类免疫缺陷病毒（HIV）-1为骨架，由3个编码病毒颗粒gag、pol、env结构的包装质粒pMD.G、pCMVHIV△8.2和pHIV-eGFP组成。包膜质粒pMD.G基因表达水疱性口炎病毒的包膜糖蛋白VSV-G[6]；包装质粒pCMV-HIV△8.2用于表达病毒的结构蛋白以及病毒复制所需的酶等[7]。由于JSRV-NM病毒不能通过常规培养方法在体外复制和扩增，本研究在慢病毒载体系统基础上，构建以JSRV-NM病毒env基因为包膜质粒，替代包膜VSV-G的质粒pMD.G，重组构建“JSRV-NM假病毒”，报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂和细胞 DMEM培养基、胎牛血清购自HyClone公司；HEPES、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸购自Sigma公司；SOB培养液、Lipofectamine 2000和Trizol购自Invitrogen公司；real-time PCR和RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司；质粒去内毒素大提试剂盒购自QIAGEN公司。其他试剂均为常用国产分析纯级化学试剂。质粒转化宿主菌为DH5α菌株。

1.2 细胞培养 人胚肾细胞系293T细胞、Hela细胞用含10％胎牛血清和100 g/L链霉素及100 U/mL青霉素的DMEM培养基培养。其培养均在37℃、5％CO2条件下进行。

1.3 慢病毒质粒系统 慢病毒载体系统由pMD.G、pCMVHIV△8.2和pHIV-eGFP质粒组成(法国国家医学与健康研究院杨光华博士惠赠)。JSRV的env包膜质粒pCMV3JS21GP（英国格拉斯哥大学比较医学研究院Massimo Palmarini教授惠赠）。JSRV-NM的env包膜质粒pCMVJSRV-NM由本实验室构建。主要是JSRV-NM的env序列由PCR法扩增，插入pCI-neo载体，其启动子为人巨细胞病毒（CMV）。

1.4 质粒的纯化 将pHIV-eGFP、pCMV-HIV△8.2、pMD.G、pCMV3JS21GP、pCMVJSRV-NM等质粒分别转化到高效感受态DH5α细胞中，涂板后37℃培养12～16 h。挑单个菌落于含3～5 mL SOB培养液的试管中震荡培养8 h，然后取200µL菌液于含200 mLSOB培养液的锥形瓶中震荡培养12～16 h，待光密度（OD）600值达到0.6～1.0时，按照QIAGEN去内毒素试剂盒步骤纯化质粒。

1.5 慢病毒载体的包装 用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以密度0.5×106/mL接种于直径为15 cm的细胞培养皿，37℃，5％CO2培养，待密度达60％～70％时转染，转染前1 d将细胞培养液更换为不含抗生素的培养液。包装DNA溶液分别为JSRV-NM包膜质粒pCMVJSRV-NM（12µg），JSRV-21包膜质粒pCMV3JS21GP（10µg），VSV-G包膜质粒pMD.G（7µg），质粒pCMV-HIV△8.2（8µg），pHIV-eGFP（10 µg）。将DNA溶液与转染试剂Lipofectamine 2000混合并转染293T细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养12 h后倒去含有转染混合物的培养液，加PBS液漂洗，然后加入含10％血清的细胞培养液15 mL，培养箱内继续培养48 h，收集293T细胞上清液。4℃，4 000×g离心10 min，以0.45 μm滤器过滤后置于40 mL超速离心管中；4℃，25 000 r/min离心20 min；而后以冰PBS液重悬病毒沉淀，于4℃溶解过夜即得到病毒液Lv-JSRV-NM、Lv-JSRV-21。同法获得阳性对照和阴性对照病毒液Lv-VSV-G、Lv-Negative。以每管10 μL分装病毒液置于-80℃冰箱中保存。

1.6 real-time PCR测定病毒滴度 用real-time PCR检测整合到Hela细胞基因组中的慢病毒WPRE序列来测定成功感染进细胞的病毒滴度(单位TU/mL)，重复3次。接种Hela细胞于24孔板，每孔5×104个细胞，培养24 h后，将稀释病毒液感染Hela细胞，12 h后换液。感染72 h后，提取Hela细胞基因组DNA，PCR引物为：正义5′-CCGTTTCAGGCAACGTG-3′；反义5′-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3′；探针FAMTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTAMRA。real-time PCR反应条件：50℃2 min；95℃15 min；95℃15 s，60℃1 min，40个循环。按以下公式计算：病毒滴度＝5×104（Hela细胞数）×每个细胞的WPRE序列拷贝数/孔中加入病毒原液的体积(mL)，具体方法见文献[8]。

1.7 重组JSRV-NM慢病毒的感染力检测 将上述1.6测定浓度的Lv-JSRV-NM及Lv-VSV-G分别按感染复数（multiplicity of infection，MOI）=3的比例感染Hela细胞，48 h后收集细胞进行real-time PCR检测整合到Hela细胞基因组中的慢病毒WPRE序列，比较两种包膜感染力。Hela细胞以浓度2× 105个/mL接种于24孔板中，每孔加500µL含10％胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养过夜。吸去原培养液，加504µL含2％胎牛血清和病毒（4µL病毒液，MOI=3）的DMEM培养液，37℃，5％CO2继续培养过夜后，吸掉该培养液，再加500µL含10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养，72 h后，行real-time PCR检测基因表达情况，方法详见文献[8]。

2 结果

2.1 高质量去内毒素质粒纯化 采用QIAGEN无内毒素质粒纯化试剂盒，获得高质量的质粒pHIV-eGFP(450 mg/L)、pCMV-HIV△8.2(400 mg/L)、pMD.G (400mg/L)、pCMVJSRV-NM（350mg/L）、pCMV3JS21GP （380mg/L）。

2.2 假病毒的包装 转染293T细胞24 h后，在荧光显微镜下观察到293T细胞中表达绿色荧光，证实了eGFP基因的表达。转染48 h后，细胞中荧光强度较转染24 h时有所增强，由此慢病毒载体由293T细胞包装产生。包装的假病毒中含有报告基因eGFP，成功重组包装的病毒可以看到绿色荧光，见图1、2。外层用JSRV-NM病毒包膜代替了VSV病毒的包膜。

2.3 假病毒的滴度测定 Lv-JSRV-NM的滴度为1.0×108TU/mL，Lv-VSV-G为1.2×108TU/mL，Lv-JS-RV-21为1.5×108TU/mL、Lv-Negative为1.6×108TU/mL。

2.4 感染力 Lv-JSRV-NM的感染率为86.7％，Lv-VSV-G为82.9％。

Fig.1 The green fluorescence are Lv-VSV-G(×200)图1 绿色荧光为Lv-VSV-G(×200)

Fig.2 The green fluorescence are Lv-JSRV-NM(×200)图2 绿色荧光为Lv-JSRV-NM(×200)

3 讨论

本研究在以往研究JSRV-NM病毒[5]和构建慢病毒的基础上[8]，构建了以JSRV-NM病毒的env包膜质粒替代VSV病毒的糖蛋白G包膜质粒，通过荧光检测成功重组了新的基于慢病毒质粒结构的“JSRV-NM假病毒”。real-time PCR检测显示Lv-JSRV-NM包膜与Lv-VSV-G包膜具有一样的功能及相同的感染能力。这不仅解决了JSRV-NM病毒不能在体外细胞复制和扩增的问题，且能更好地解决控制病毒的扩增数量、感染力和安全性问题，为进一步深入研究奠定了基础。

采用基于慢病毒质粒结构重组的JSRV-NM假病毒具有更高的安全性，主要是因为笔者采用的慢病毒载体是一个将载体3′端长末端重复序列中的U3区增强子和启动子序列去除的自身失活（self-inactivating，SIN）的载体[9]，这种结构组成能大大降低假病毒感染细胞后产生可复制的子代病毒的可能性。故JSRV-NM假病毒只具有一次感染能力，感染细胞模型后就不具有复制子代病毒的能力，同样也没有发现有基因突变和扩增出子代病毒及缺陷病毒等，故称之为“假病毒”，具有很高的安全性，符合二级生物实验室安全的要求。JSRV-NM包膜赋予重组JSRV-NM假病毒颗粒高度的稳定性，JSRV-NM 的env包膜与VSV-G包膜一样使病毒颗粒的稳定性增加，能够通过超速离心被浓缩成高滴度病毒，达到1×108TU/mL的高滴度。笔者也与Massimo Palmarini教授的JSRV21病毒包膜进行了比较[10]，发现JSRV-NM假病毒与其一样有很好的感染能力。近来研究发现JSRV假病毒包膜侵入宿主细胞时是pH依赖型进行细胞膜融合[11]，为进一步研究提供很好的方向。

综上，基于慢病毒质粒结构的高效包装系统，本研究成功构建了JSRV-NM假病毒，具有更高的安全性、稳定性、感染能力，解决了JSRV-NM的体外复制和扩增问题，为今后进一步深入研究JSRV-NM的env包膜引起的跨种属感染，及env包膜致瘤性引起的肺腺癌的机制奠定了基础。

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（2014-01-10收稿 2014-03-20修回）

（本文编辑 闫娟）

Construction of JSRV-NM Pseudovirions by High Efficiency Packaging System of the Lentivirus

GONG Shumin1，LI Guangming2，WU Zhimin2，DONG Lizhen2，CHENG Bin2，ZHANG Bin2，ZHU Ze2
1 The Fourth Hospital of Tianjin,Tianjin 300222,China;2 Department of Medical Microbiology,Tianjin Medical University ZHU Ze,E-mail:zhuze_2006@126.com

ObjectiveTo overcome the fact that SRV-NM virus can only multiple and amplify through partially purified jaagsiekte retrovirus inoculated intratracheally in sheep but it cannot be augmented using in vitro cell culture,we constructed JSRV-NM pseudovirions based on high efficiency packing system of lentivirus.MethodsLentivirus of three high efficiency packing plasmids system pMD.G,pCMV-HIV 8.2 and pHIV-eGFP was developed,and JSRV-NM-env coated plasmid pCMVJSRV-NM was used to substitute VSV-G virus coated plasmid pMD.G then co-transfected into 293T cells to replicate,package and produce restructured JSRV-NM pseudovirions.Gene expression of pseudovirion was determined through WPRE using real time PCR;Virus infectivity was detected through inoculating JSRV-NM pseudovirions into 24 pore plates.ResultsWe construct JSRV-NM pseudovirions successfully based on the lentivirus system.JSRV-NM pseudovirions can also be concentrated to higher titer(108TU/mL detected by real time PCR by ultracentrifugation without significant loss of activity.JSRV-NM and VSV-G pseudovirions infected on Hela cells(both MOI=3)respectively and no obvious difference were shown on their infection efficiency detected by real time PCR.ConclusionBased on lentivirus system, JSRV-NM pseudovirions can be multipled and amplified in 293T cell culture in vitro.JSRV-NM pseudovirions is stable without loss its infection activity and the requirements of biological laboratory safety II was also met.JSRV-NM pseudovirions will provide a useful tool for further study of JSRV-NM–env infection across species or its induction of lung adenocarcinoma.

JSRV-NM viruses；pseudovirions；lentivirus vector；env gene；virus packageing

Q939.47

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.004

国家自然科学基金资助项目(30772483)，天津市自然科学基金重点项目(08JCZDJC23400)

1天津市第四医院（邮编300222）;2天津医科大学基础医学院病原生物学教研室

△通讯作者 E-mail:zhuze_2006@126.com