光谱法研究辛伐他汀与牛血清白蛋白的相互作用

张红颖，陈宁生，张文龙

（安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000）

辛伐他汀（Simvastatin，Sim）是由美国默沙东公司（Merck ＆Co.）研制的一种HMG－CoA还原酶抑制剂，通过抑制HMG－CoA还原酶的活性控制人体内源性胆固醇的合成，调节血液中胆固醇的含量，可有效降低心血管疾病的发病率和死亡率，并具有抗氧化、抗血栓和抗炎等功能［1］，其结构式如图1所示.

图1 Sim结构式

血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，对内源和外源性物质都有特异性的结合，因而在体内起着重要的运输作用.牛血清白蛋白（BSA）与人血清白蛋白（HSA）有着相似的结构与序列，是一种应用广泛的血清白蛋白［2］.以BSA作为血清白蛋白的模型，研究Sim与BSA在模拟生理条件下的相互作用.不仅从机理上透彻分析，而且研究了Sim在与BSA结合过程中BSA构象及微环境的变化，对控制Sim在生物体内的运输、代谢，阐明其药代机理、指导合理有效地用药有着重要意义.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BSA（1.0×10－5mol/L，Sigma）；乙醇（安徽安特生物化学有限公司）；辛伐他汀（5.0×10－4mol/L，河南天方药业）；氟灭酸、保泰松（Alfa）；Tris－HCl（0.1mol/L Tris和0.1mol/L HCl溶液配成pH＝7.4的缓冲溶液，Sigma）；NaCl（0.1mol/L，用以维持离子强度）；其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水.

F－4500荧光分光光度计（日本日立公司）；TU－1901双光束紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；Jasco－20c圆二色谱仪（日本岛津）；FC－104电子天平（上海精科天平厂）；JK－400CDB型高功率数控超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）；SC－15数控超级恒温槽（上海天平仪器厂）.

1.2 实验方法

在10mL比色管中，依次加入1.0mL BSA 溶液、1.0mL Tris－HCl缓冲溶液（pH＝7.4）、1.0mL NaCl溶液，用二次蒸馏水定容，摇匀；取出3mL混合液于石英比色皿中，用微量进样器往该溶液中加入一定量的Sim，静置10min后测定荧光光谱.

荧光光谱测定条件：激发狭缝和发射狭缝均为10nm、光电管负高压400V、响应速度2.0s、波长扫描速度1 200nm/min，激发波长为280nm，置于1cm比色血中扫描300～500nm范围内发射波长的荧光强度.设置发射波长与激发波长的Δλ＝15nm、60nm，记录265～400nm、250～400nm的同步荧光.

圆二色谱测定：使用2mm的石英池，扫描在200～250nm范围内的圆二色谱.

三维荧光光谱测定：设置激发波长200～400nm 增量为5nm 其余设置同荧光光谱测定方法，扫描300～500nm内的荧光强度.

紫外－可见吸收光谱测定：将溶液置于1cm比色皿中，用紫外可见分光光度计测定200～800nm范围内的紫外可见光谱.

2 结果与讨论

2.1 Sim对BSA的荧光猝灭及机理

Sim对BSA的荧光猝灭光谱图如图2所示.由图2可知，扫描不同体系的荧光光谱发现，280nm波长激发下，Sim在300～500nm扫描范围内几乎无荧光发射；BSA具有较强的内源荧光，图2显示，向BSA中逐渐加入Sim后，BSA内源性荧光出现有规律的猝灭，且发射峰波长由350nm蓝移至348nm处，说明Sim改变了BSA内部氨基酸残基的微环境，疏水性增强，Sim与BSA可能发生相互作用［3］.

为了研究此猝灭过程是由体系中激发态分子的扩散和碰撞产生的动态猝灭，还是由基态分子之间形成了非荧光性物质的静态猝灭，先假设Sim对BSA猝灭为动态猝灭过程，则其作用过程应遵循Stern－Volmer方程［3］：F0/F＝1＋Kqτ0［Q］＝1＋Ksv［Q］.式中，F0为BSA溶液的荧光强度；F为加入Sim后BSA溶液的荧光强度；Kq为双分子猝灭过程的速率常数；τ0为BSA分子的平均寿命（τ0约10－8s）［4］；Ksv为Stern－Volmer的动态猝灭常数，［Q］为Sim的游离浓度.

图2 Sim对BSA的荧光猝灭光谱图

图3 Sim对BSA的荧光猝灭Stern－Volmer图

用不同温度下的F0/F对［Q］作图（见图3），得到Ksv和Kq，如表1所示.由表1可知，Ksv随温度的升高而降低，不同温度下的Kq都大于最大扩散碰撞猝灭速率常数2.0×1010L/mol/s［5］，说明Sim与BSA形成了非荧光性的基态复合物，Sim以静态猝灭方式猝灭了BSA的内源性荧光.

表1 不同温度下Sim与BSA间的猝灭反应参数

据Förster型偶极 －偶极非辐射能量转移理论［6］，将 Sim（2.5×10－6mol/L）吸收光谱与 BSA（1.0×10－6mol/L）荧光光谱重叠部分积分，得到积分值J＝3.307×10－15cm3/L/mol，由此计算出E＝0.17、R0＝1.4nm、r＝1.8nm.Sim与BSA氨基酸残基的结合部位距离为1.8nm，远小于8nm［7］，说明Sim与BSA的结合伴随着非辐射能量转移.

图4 BSA－Sim的lg［（F0－F）/F］对lg［Q］图

2.2 结合常数、结合位置及位点数、作用力

根据静态猝灭公式：

式中KA为Sim与BSA的结合常数，n为结合位点数.

作lg［（F0－F）/F］～lg［Q］关系图并线性拟合（见图4），由直线斜率和截距可求出Sim与BSA的结合常数KA及结合位点数n.其结果如表1所示.由表1可知，Sim与BSA的结合常数KA的数量级达到为105，说明Sim对BSA有较强的结合作用可形成较稳定的复合物［7］，Sim的脂溶性较好，与BSA结合距离较近的结论相符；随着温度的升高，结合常数有所减小，温度升高不利于复合物的稳定；在不同温度下的平均结合位点数约为1，说明Sim对BSA只有一个结合位点，两者生成了1：1的复合物［7－8］.由范德霍夫等温方程式和热力学函数关系［9］，可得到此结合反应热力学焓变ΔHθ＜0，熵变ΔSθ＜0，ΔGθ＜0，由此可推测：Sim与BSA间主要作用力为氢键或范德华力，Sim与BSA生成复合物的过程为自发过程.

大多数药物与BSA的结合部位在siteⅠ Sub－domainⅡA 和siteⅡ Sub－domainⅢA[10].常用保泰松和氟灭酸作为判断siteⅠ和siteⅡ位的标记性药物，如果Sim与标记性药物具有相同的结合部位，那么两者就会发生竞争作用，标记性药物置换出已和BSA结合的Sim.用同浓度的保泰松和氟灭酸对BSASim进行实验，结果如表2所示，保泰松对BSA－Sim体系的影响较大，而氟灭酸对BSA－Sim体系的影响较小.说明Sim与保泰松竞争同一结合部位，使结合常数明显降低，因此Sim与BSA的结合部位在siteⅠ.

表2 标记药物存在下对BSA－Sim的结合常数的影响

2.3 同步荧光光谱

同步荧光法常用于蛋白质构象的分析［11］.Δλ＝15nm、60nm时，分别显示Tyr和Trp的荧光特性［12］，其同步荧光光谱图如图5所示.由图5可知，BSA中Trp和Tyr都具有荧光，但是其内源荧光主要由Trp残基贡献，且随着Sim的加入，同步荧光强度都相应的减小，峰形基本不变，但Trp的最大发射峰发生微弱蓝移，Tyr的最大发射峰并未移动，Sim与BSA的作用部位主要在Trp周围.Trp残基分别位于BSA分子中第134和212位，分属于ⅠB和ⅡA亚结构域，其中第212位残基位于BSA的疏水腔内表面，说明Sim与BSA的相互作用，主要改变第212位残基Trp所处的微环境，使其疏水性增强.

2.4 圆二色谱

为了进一步考察Sim与BSA的相互作用及BSA内部二级结构的变化情况，扫描了加入Sim前后的圆二色谱如图6所示.由图6可知，BSA在208nm处有明显的负cotton效应，加入Sim后负峰强度增大，BSA中α－螺旋结构的含量发生了变化［13］.用计算机自带软件计算结果如表3所示，由表3中可知，加入Sim后，BSA的各种二级结构都发生了不同变化，其α－螺旋含量由29.9%下降到27.6%，β－折叠由19.7%上升到34.8%，α－螺旋、β－转角、无规卷曲都不同幅度的转变为β－折叠.可能是因为Sim通过氢键和范德华力与BSA分子的氨基酸残基相互作用，导致BSA分子中各种二级结构含量的改变.

图5 BSA－Sim的同步荧光光谱

图6 BSA、BSA－Sim的圆二色谱

表3 BSA、BSA－Sim的二级结构含量

2.5 三维荧光光谱

图7 BSA（A）与BSA－Sim（B）体系的三维荧光光谱

实验条件下分别测BSA、BSA－Sim的三维荧光光谱图如图7所示.由图7可知，峰a为瑞利散射峰，加入Sim后峰a荧光强度加强，可能是Sim与BSA生成复合物后使溶液中溶质的粒径增加，散射效应增强.BSA的两个荧光峰的峰顶坐标（F，λex/λem）分 别 为 peak1（187.5，280/345），peak2（217.8，225/345）.Peak1主要是色氨酸和酪氨酸的光谱特征峰，是研究荧光猝灭的主荧光峰.Peak2反应了多肽主链的荧光性质，其荧光强度与蛋白质的二级结构密切相关.加入Sim后两个荧光峰的峰顶坐标分别为peak1（176.9，280/345），peak2（204.1，230/345）.从峰强分析可知，Sim 的加入使峰1和峰2都发生明显的降低，峰的荧光强度发生了猝灭，蛋白质的二级结构也发生相应的变化.从峰位分析可知，Sim的加入使峰2红移了5nm，结合圆二及红外光谱表明Sim与BSA的结合部位可能位于氨基酸残基所处的疏水腔内，Sim的加入使疏水腔内的极性增加，进而导致BSA构象的变化.

3 结论

Sim静态猝灭了BSA的内源性荧光，其作用力类型为氢键和范德华力，结合部位主要在siteⅠ.金属离子的加入对Sim与BSA体系产生影响.圆二色谱显示，Sim对BSA的β－折叠区有较大影响.这对研究Sim在生物体内的代谢及指导合理用药有着重要意义.

［1］ 陈实，李承红，叶胜兰.辛伐他汀治疗慢性阻塞性肺疾病合并代谢综合征患者的临床观察［J］.江汉大学学报，2013，4（1）：83－87.

［2］ RAWEL H M，MEIDTNER K，KROLL J.Binding of Selected Phenolic Compounds to Proteins［J］.J.Agric Food Chem.，2005，53（10）：4 228.

［3］ WANG Y Q，ZHANG H M，ZHANG G C，et al.Spectroscopic Studies on the Interaction Between Silicotungstic Acid and Bovine Serum Albumin［J］.J.Pharmaceut.Biomed，2007，43（1）：1 869－1 875.

［4］ ZHANG G，ZHAO N，WANG L.Fluorescence spectrometric studies on the binding of puerarin to human serum albumin using warfarin，ibuprofen and digito Simin as site markers with the aid of chemometrics［J］.Journal of Luminescence，2011，131（12）：2 716－2 724.

［5］ WARE W R.Oxygen quenching of fluorescence in solution.An experimental study of the diffusion process［J］.J Phys Chem.，1962，66（3）：455－458.

［6］ FörsterT.Intermolecular energy transference and fluorescence［J］.Ann Phys，1948，2：55－75.

［7］ 张秋兰，倪永年.沙丁胺醇和特布他林与牛血清白蛋白作用机理研究［J］.化学研究与应用，2011，23（6）：673－678.

［8］ 余燕敏，冯金朝，刘颖.Fe3＋存在下磺胺甲恶唑与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究［J］.化学学报，2011，69（2）：190－198.

［9］ 陈昌云，李小华，许飞，等.普利沙星与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究［J］.南京师大学报，2006，1（29）：62－65.

［10］ 汪双双，倪永年.光谱法研究11－羟基喜树碱与牛血清白蛋白的相互作用［J］.分析实验室，2010，1（29）：10－13.

［11］ 梁彦秋，臧树良，赵雪.头孢他啶与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用［J］.光谱实验室，2009，6（26）：1 638－1 642.

［12］ HU Y J，LIU Y，ZHAO R M，et al.Spectroscopic Studies on the Interaction Between Methylene Blue and Bovine Serum Albumin［J］.J.Photochem Photobiol A：Chemistry，2006，179：324－329.

［13］ 张静，向迅，方婷，等.吲哚美辛与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究［J］.化学研究与应用，2011，7（23）：834－839.